Рентгеновская кристаллография — это экспериментальная наука об определении атомной и молекулярной структуры кристалла, в которой кристаллическая структура заставляет пучок падающих рентгеновских лучей дифрагировать в определенных направлениях. Измеряя углы и интенсивности дифракции рентгеновских лучей, кристаллограф может получить трехмерную картину плотности электронов внутри кристалла и положения атомов, а также их химических связей, кристаллографического беспорядка и другой информации.
Рентгеновская кристаллография сыграла основополагающую роль в развитии многих научных областей. В первые десятилетия своего использования этот метод определял размер атомов, длину и тип химических связей, а также различия в атомном масштабе между различными материалами, особенно минералами и сплавами. Метод также выявил структуру и функцию многих биологических молекул, включая витамины, лекарства, белки и нуклеиновые кислоты, такие как ДНК. Рентгеновская кристаллография по-прежнему является основным методом для характеристики атомной структуры материалов и дифференциации материалов, которые кажутся похожими в других экспериментах. Рентгеновские кристаллические структуры также могут помочь объяснить необычные электронные или упругие свойства материала, пролить свет на химические взаимодействия и процессы или служить основой для разработки фармацевтических препаратов против болезней.
Современная работа включает в себя ряд этапов, каждый из которых важен. Предварительные этапы включают подготовку образцов хорошего качества, тщательную регистрацию дифрагированных интенсивностей и обработку данных для удаления артефактов. Затем для получения оценки атомной структуры используются различные методы, которые в общем называются прямыми методами. После первоначальной оценки для завершения структуры используются дальнейшие вычислительные методы, такие как те, которые включают карты разностей. Заключительный этап — численное уточнение атомных позиций по сравнению с экспериментальными данными, иногда с помощью ab-initio расчетов. Почти во всех случаях новые структуры размещаются в базах данных, доступных международному сообществу.
История
Кристаллы, хотя издавна восхищались их регулярностью и симметрией, не исследовались научными методами до 17 века. Иоганн Кеплер в своей работе Strena seu de Nive Sexangula (Новогодний подарок шестиугольного снега) (1611 г.) выдвинул гипотезу, что гексагональная симметрия кристаллов снежинок обусловлена регулярной упаковкой сферических частиц воды. Датский учёный Николас Стено (1669) был пионером экспериментальных исследований симметрии кристаллов. Стено показал, что углы между гранями одинаковы в каждом экземпляре кристалла определенного типа. Рене Жюст Аюи (1784) обнаружил, что каждую грань кристалла можно описать простыми схемами укладки блоков одинаковой формы и размера. Таким образом, Уильям Хэллоуз Миллер в 1839 году смог присвоить каждой грани уникальную метку из трех маленьких целых чисел — индексов Миллера, которые до сих пор используются для идентификации граней кристалла. Исследование Гаюи привело к идее, что кристаллы представляют собой регулярный трехмерный массив (решетка Браве) атомов и молекул; одна элементарная ячейка повторяется бесконечно по трем основным направлениям. В XIX веке полный каталог возможных симметрий кристалла был разработан Иоганном Хесселем, Огюстом Браве, Евграфом Федоровым, Артуром Шенфлисом и (с опозданием) Уильямом Барлоу (1894). Барлоу предложил несколько кристаллических структур в 1880-х годах, которые позже были подтверждены рентгеновской кристаллографией; однако в 1880-х годах доступных данных было слишком мало, чтобы можно было признать его модели убедительными.
Вильгельм Рентген открыл рентгеновские лучи в 1895 году. Физики не были уверены в природе рентгеновских лучей, но подозревали, что это волны электромагнитного излучения. Теория электромагнитного излучения Максвелла была хорошо принята, и эксперименты Чарльза Гловера Барклы показали, что рентгеновские лучи демонстрируют явления, связанные с электромагнитными волнами, включая поперечную поляризацию и спектральные линии, родственные тем, которые наблюдаются в видимых длинах волн. Баркла создал рентгеновскую нотацию для резких спектральных линий, отметив в 1909 году две отдельные энергии, сначала назвав их «A» и «B», а затем предположив, что могут быть линии до «A», он начал алфавитную нумерацию, начинающуюся с «K». Эксперименты с одной щелью в лаборатории Арнольда Зоммерфельда показали, что рентгеновские лучи имеют длину волны около 1 ангстрема. Рентгеновские лучи — это не только волны, но и свойства частиц, из-за чего Зоммерфельд придумал название «тормозное излучение» для непрерывных спектров, которые образовывались при бомбардировке материала электронами. Альберт Эйнштейн ввел концепцию фотона в 1905 году, но она не была широко принята до 1922 года, когда Артур Комптон подтвердил ее путем рассеяния рентгеновских лучей электронами. Корпускулярные свойства рентгеновских лучей, такие как ионизация газов, побудили Уильяма Генри Брэгга в 1907 году утверждать, что рентгеновские лучи не являются электромагнитным излучением. Точка зрения Брэгга оказалась непопулярной, и наблюдение дифракции рентгеновских лучей Максом фон Лауэ в 1912 году подтвердило, что рентгеновские лучи являются формой электромагнитного излучения.
Идея о том, что кристаллы можно использовать в качестве дифракционной решетки для рентгеновских лучей, возникла в 1912 году в беседе между Паулем Петером Эвальдом и Максом фон Лауэ в Английском саду в Мюнхене. Эвальд предложил резонаторную модель кристаллов для своей диссертации, но эта модель не могла быть проверена с использованием видимого света, поскольку длина волны была намного больше, чем расстояние между резонаторами. Фон Лауэ понял, что необходимо электромагнитное излучение с более короткой длиной волны, и предположил, что рентгеновские лучи могут иметь длину волны, сопоставимую с расстоянием между элементарными ячейками в кристаллах. Фон Лауэ работал с двумя техниками, Вальтером Фридрихом и его помощником Паулем Книппингом, чтобы просвечивать рентгеновским лучом кристалл сульфата меди и регистрировать его дифракцию на фотографической пластине. После проявления пластина показала большое количество четко определенных пятен, расположенных в узоре пересекающихся кругов вокруг пятна, созданного центральным лучом. Результаты были представлены Баварской академии наук и гуманитарных наук в июне 1912 года под названием «Interferenz-Erscheinungen bei Röntgenstrahlen» (Явления интерференции в рентгеновских лучах). Фон Лауэ разработал закон, связывающий углы рассеяния с размером и ориентацией промежутков между элементарными ячейками в кристалле, за что в 1914 году ему была присуждена Нобелевская премия по физике.
После пионерских исследований фон Лауэ эта область быстро развивалась, в первую очередь физиками Уильямом Лоуренсом Брэггом и его отцом Уильямом Генри Брэггом. В 1912–1913 годах младший Брэгг разработал закон Брэгга, который связывает рассеяние с равномерно расположенными плоскостями внутри кристалла. Брэгги, отец и сын, разделили Нобелевскую премию по физике 1915 года за свою работу в области кристаллографии. Самые ранние структуры были, как правило, простыми; по мере того, как вычислительные и экспериментальные методы совершенствовались в течение следующих десятилетий, стало возможным выводить надежные атомные позиции для более сложных расположений атомов.
Самые ранние структуры представляли собой простые неорганические кристаллы и минералы, но даже они раскрыли фундаментальные законы физики и химии. Первой структурой с атомным разрешением, которая была «решена» (т. е. определена) в 1914 году, была структура поваренной соли. Распределение электронов в структуре поваренной соли показало, что кристаллы не обязательно состоят из ковалентно связанных молекул, и доказало существование ионных соединений. Структура алмаза была решена в том же году, доказав тетраэдрическое расположение его химических связей и показав, что длина одинарной связи C–C составляет около 1,52 ангстрем. Другие ранние структуры включали медь, фторид кальция (CaF2, также известный как флюорит), кальцит (CaCO3) и пирит (FeS2) в 1914 году; шпинель (MgAl2O4) в 1915 году; рутил и анатаз формы диоксида титана (TiO2) в 1916 году; пирохроит (Mn(OH)2) и, соответственно, брусит (Mg(OH)2) в 1919 году. Также в 1919 году Ральф Уолтер Грейстоун Вайкофф определил нитрат натрия (NaNO3) и дихлориодид цезия (CsICl2), а в 1920 году была определена структура вюрцита (гексагональная структура ZnS).
Структура графита была решена в 1916 году с помощью родственного метода порошковой дифракции, который был разработан Питером Дебаем и Полом Шеррером и, независимо, Альбертом Халлом в 1917 году. Структура графита была определена с помощью монокристаллической дифракции в 1924 году двумя группами независимо. Халл также использовал порошковый метод для определения структур различных металлов, таких как железо и магний.
Вклад в различных областях
Химия
Рентгеновская кристаллография привела к лучшему пониманию химических связей и нековалентных взаимодействий. Первоначальные исследования выявили типичные радиусы атомов и подтвердили многие теоретические модели химической связи, такие как тетраэдрическая связь углерода в структуре алмаза, октаэдрическая связь металлов, наблюдаемая в гексахлорплатинате аммония (IV), и резонанс, наблюдаемый в плоская карбонатная группа и в ароматических молекулах. Структура гексаметилбензола, предложенная Кэтлин Лонсдейл в 1928 году, установила гексагональную симметрию бензола и показала четкую разницу в длине связей между алифатическими связями C–C и ароматическими связями C–C; это открытие привело к идее о резонансе между химическими связями, что имело глубокие последствия для развития химии. Ее выводы были предвосхищены Уильямом Генри Брэггом, опубликовавшим в 1921 году модели нафталина и антрацена, основанные на других молекулах, что является ранней формой молекулярного замещения.
Первая структура органического соединения, гексаметилентетрамина, была решена в 1923 году. За этим быстро последовало несколько исследований различных длинноцепочечных жирных кислот, которые являются важным компонентом биологических мембран. В 1930-х годах начали решать структуры гораздо более крупных молекул с двумерной сложностью. Значительным достижением стала структура фталоцианина, большой плоской молекулы, которая тесно связана с молекулами порфиринов, важными в биологии, такими как гем, коррин и хлорофилл.
В 1920-х годах Виктор Мориц Гольдшмидт, а позднее Лайнус Полинг разработали правила исключения химически маловероятных структур и определения относительных размеров атомов. Эти правила привели к структуре брукита (1928) и пониманию относительной стабильности рутильной, брукитовой и анатазной форм диоксида титана.
Расстояние между двумя связанными атомами является чувствительной мерой прочности связи и ее порядка; таким образом, рентгеновская кристаллография привела к открытию еще более экзотических типов связей в неорганической химии, таких как двойные связи металл-металл, четверные связи металл-металл и трехцентровые двухэлектронные связи. Рентгеновская кристаллография — или, строго говоря, эксперимент по неупругому комптоновскому рассеянию — также предоставила доказательства частично ковалентного характера водородных связей. В области металлоорганической химии рентгеновская структура ферроцена инициировала научные исследования сэндвичевых соединений, в то время как структура соли Цейзе стимулировала исследования «обратной связи» и комплексов металл-пи. Наконец, рентгеновская кристаллография сыграла пионерскую роль в развитии супрамолекулярной химии, особенно в прояснении структур краун-эфиров и принципов химии хозяин-гость.
Материаловедение и минералогия
Применение рентгеновской кристаллографии в минералогии началось со структуры граната, которая была определена в 1924 году Менцером. Систематическое рентгеновское кристаллографическое исследование силикатов было предпринято в 1920-х годах. Это исследование показало, что при изменении соотношения Si/O кристаллы силикатов демонстрируют значительные изменения в своих атомных расположениях. Махачки распространил эти идеи на минералы, в которых алюминий заменяет атомы кремния силикатов. Первое применение рентгеновской кристаллографии в металлургии также произошло в середине 1920-х годов. В частности, структура сплава Mg2Sn, разработанная Лайнусом Полингом, привела к его теории стабильности и структуры сложных ионных кристаллов. Многие сложные неорганические и металлоорганические системы были проанализированы с использованием методов монокристаллов, таких как фуллерены, металлопорфирины и другие сложные соединения. Дифракция монокристаллов также используется в фармацевтической промышленности. По состоянию на июнь 2019 года Кембриджская база структурных данных содержит более 1 000 000 структур; большинство из этих структур были определены методом рентгеновской кристаллографии.
17 октября 2012 года марсоход Curiosity на планете Марс в комплексе «Рокнест» выполнил первый рентгеноструктурный анализ марсианского грунта. Результаты анализатора CheMin марсохода выявили наличие нескольких минералов, в том числе полевого шпата, пироксенов и оливина, и предположили, что марсианская почва в образце была похожа на «выветрелые базальтовые почвы» гавайских вулканов.
Биологическая макромолекулярная кристаллография
Рентгеновская кристаллография биологических молекул началась с Дороти Кроуфут-Ходжкин, которая расшифровала структуры холестерина (1937), пенициллина (1946) и витамина B12 (1956), за что в 1964 году была удостоена Нобелевской премии по химии. В 1969 году ей удалось расшифровать структуру инсулина, над чем она работала более тридцати лет.
Кристаллические структуры белков (которые нерегулярны и в сотни раз больше холестерина) начали решать в конце 1950-х годов, начиная со структуры миоглобина кашалота сэром Джоном Каудери Кендрю, за которую он разделил Нобелевскую премию по химии с Максом Перуцем в 1962 году. С тех пор было определено более 130 000 рентгеновских кристаллических структур белков, нуклеиновых кислот и других биологических молекул. Ближайшим конкурирующим методом по количеству проанализированных структур является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которая разрешила менее одной десятой от этого количества. Кристаллография может решать структуры произвольно больших молекул, тогда как ЯМР в состоянии раствора ограничен относительно малыми (менее 70 кДа). Рентгеновская кристаллография обычно используется для определения того, как фармацевтический препарат взаимодействует с его белковой мишенью и какие изменения могут его улучшить. Однако внутренние мембранные белки по-прежнему трудно кристаллизовать, поскольку для их изолированного растворения требуются детергенты или другие денатуранты, а такие детергенты часто мешают кристаллизации. Мембранные белки являются крупным компонентом генома и включают в себя множество белков, имеющих большое физиологическое значение, таких как ионные каналы и рецепторы. Гелиевая криогеника используется для предотвращения радиационного повреждения кристаллов белков.
Методы
Обзор рентгеновской дифракции монокристаллов
Самым старым и точным методом рентгеновской кристаллографии является рентгеновская дифракция на монокристалле, при которой пучок рентгеновских лучей освещает
Часто используются два предельных случая рентгеновской кристаллографии — «малая молекула» (которая включает непрерывные неорганические твердые тела) и «макромолекулярная» кристаллография. Малая молекула кристаллографии обычно включает кристаллы с менее чем 100 атомами в их асимметричной единице; такие кристаллические структуры обычно настолько хорошо разрешены, что атомы можно различить как изолированные «капли» электронной плотности. Напротив, макромолекулярная кристаллография часто включает десятки тысяч атомов в элементарной ячейке. Такие кристаллические структуры, как правило, менее хорошо разрешены; атомы и химические связи выглядят как трубки электронной плотности, а не как изолированные атомы. В целом, малые молекулы также легче кристаллизовать, чем макромолекулы; однако рентгеновская кристаллография оказалась возможной даже для вирусов и белков с сотнями тысяч атомов благодаря улучшенной кристаллографической визуализации и технологии.
Методика рентгеновской кристаллографии монокристаллов состоит из трех основных этапов. Первый и часто самый сложный этап — получение адекватного кристалла исследуемого материала. Кристалл должен быть достаточно большим (обычно больше 0,1 мм во всех измерениях), чистым по составу и регулярной по структуре, без существенных внутренних дефектов, таких как трещины или двойникование.
На втором этапе кристалл помещают в интенсивный пучок рентгеновских лучей, обычно одной длины волны (монохроматические рентгеновские лучи), создавая регулярную картину отражений. Измеряются углы и интенсивности дифрагированных рентгеновских лучей, причем каждое соединение имеет уникальную картину дифракции. По мере постепенного вращения кристалла предыдущие отражения исчезают и появляются новые; интенсивность каждого пятна регистрируется при каждой ориентации кристалла. Может потребоваться собрать несколько наборов данных, причем каждый набор покрывает немного больше половины полного оборота кристалла и обычно содержит десятки тысяч отражений.
На третьем этапе эти данные объединяются вычислительным путем с дополнительной химической информацией для создания и уточнения модели расположения атомов внутри кристалла. Окончательная, уточненная модель расположения атомов — теперь называемая кристаллической структурой — обычно хранится в общедоступной базе данных.
Кристаллизация
Хотя кристаллография может быть использована для характеристики беспорядка в нечистом или нерегулярном кристалле, кристаллография обычно требует чистого кристалла высокой регулярности для решения структуры сложного расположения атомов. Чистые, регулярные кристаллы иногда могут быть получены из природных или синтетических материалов, таких как образцы металлов, минералов или других макроскопических материалов. Регулярность таких кристаллов иногда может быть улучшена с помощью отжига макромолекулярных кристаллов и других методов. Однако во многих случаях получение кристалла дифракционного качества является главным препятствием для решения его структуры с атомным разрешением.
Кристаллография малых молекул и макромолекул отличается диапазоном возможных методов, используемых для получения кристаллов дифракционного качества. Малые молекулы, как правило, имеют мало степеней конформационной свободы и могут быть кристаллизованы широким спектром методов, таких как химическое осаждение из паровой фазы и перекристаллизация. Напротив, макромолекулы, как правило, имеют много степеней свободы, и их кристаллизация должна проводиться таким образом, чтобы поддерживать стабильную структуру. Например, белки и более крупные молекулы РНК не могут быть кристаллизованы, если их третичная структура развернута; поэтому диапазон условий кристаллизации ограничен условиями раствора, в которых такие молекулы остаются свернутыми.
Кристаллы белка почти всегда выращиваются в растворе. Наиболее распространенный подход заключается в очень постепенном снижении растворимости его молекул-компонентов; если это сделать слишком быстро, молекулы выпадут в осадок из раствора, образуя бесполезную пыль или аморфный гель на дне контейнера. Рост кристаллов в растворе характеризуется двумя этапами: зарождением микроскопического кристаллита (возможно, имеющего всего 100 молекул), за которым следует рост этого кристаллита, в идеале до кристалла дифракционного качества. Условия раствора, которые благоприятствуют первому этапу (зарождению), не всегда являются теми же условиями, которые благоприятствуют второму этапу (последующему росту). Условия раствора должны не благоприятствовать первому этапу (зарождению), но благоприятствовать второму (росту), так что на каплю образуется только один большой кристалл. Если зарождение слишком благоприятствует, в капле образуется ливень мелких кристаллитов, а не один большой кристалл; если слишком мало благоприятствует, кристаллы вообще не образуются. Другие подходы включают кристаллизацию белков под маслом, где водные растворы белков распределяются под жидким маслом, и вода испаряется через слой масла. Различные масла имеют разную проницаемость испарения, поэтому приводят к изменениям в скоростях концентрации из-за разной смеси перципиента/белка.
Трудно предсказать хорошие условия для зародышеобразования или роста хорошо упорядоченных кристаллов. На практике благоприятные условия определяются путем скрининга; готовится очень большая партия молекул и тестируется широкий спектр растворов для кристаллизации. Обычно перебираются сотни, даже тысячи условий раствора, прежде чем находят удачный. Различные условия могут использовать один или несколько физических механизмов для снижения растворимости молекулы; например, некоторые могут изменять pH, некоторые содержат соли ряда Гофмейстера или химикаты, которые снижают диэлектрическую проницаемость раствора, а другие содержат крупные полимеры, такие как полиэтиленгликоль, которые вытесняют молекулу из раствора за счет энтропийных эффектов. Также обычно пробуют несколько температур для стимуляции кристаллизации или постепенно понижают температуру, чтобы раствор стал перенасыщенным. Эти методы требуют больших количеств целевой молекулы, поскольку они используют высокую концентрацию молекулы(молекул), которая должна быть кристаллизована. Из-за сложности получения таких больших количеств (миллиграммов) кристаллизационного белка были разработаны роботы, способные точно дозировать капли кристаллизационного испытания объемом порядка 100 нанолитров. Это означает, что на эксперимент используется в 10 раз меньше белка по сравнению с кристаллизационными испытаниями, проводимыми вручную (порядка 1 микролитра).
Известно, что несколько факторов препятствуют кристаллизации. Растущие кристаллы обычно поддерживаются при постоянной температуре и защищены от ударов или вибраций, которые могут нарушить их кристаллизацию. Примеси в молекулах или в растворах для кристаллизации часто неблагоприятны для кристаллизации. Конформационная гибкость молекулы также имеет тенденцию делать кристаллизацию менее вероятной из-за энтропии. Молекулы, которые имеют тенденцию к самоорганизации в правильные спирали, часто не желают собираться в кристаллы. Кристаллы могут быть испорчены двойникованием, которое может происходить, когда элементарная ячейка может одинаково благоприятно упаковываться в нескольких ориентациях; хотя недавние достижения в вычислительных методах могут позволить решить структуру некоторых двойниковых кристаллов. Не сумев кристаллизовать целевую молекулу, кристаллограф может попробовать еще раз со слегка измененной версией молекулы; даже небольшие изменения в молекулярных свойствах могут привести к большим различиям в поведении кристаллизации.
Сбор данных
Монтаж кристалла
Кристалл устанавливается для измерений так, чтобы его можно было удерживать в рентгеновском луче и вращать. Существует несколько методов установки. Раньше кристаллы загружали в стеклянные капилляры с раствором для кристаллизации (маточным раствором). Кристаллы малых молекул обычно прикрепляли маслом или клеем к стеклянному волокну или петле, которая сделана из нейлона или пластика и прикреплена к твердому стержню. Белковые кристаллы захватываются петлей, затем мгновенно замораживаются жидким азотом. Такое замораживание уменьшает радиационное повреждение рентгеновских лучей, а также тепловое движение (эффект Дебая-Уоллера). Однако необработанные белковые кристаллы часто трескаются при мгновенной заморозке; поэтому их обычно предварительно замачивают в растворе криопротектора перед замораживанием. Это предварительное замачивание само по себе может привести к растрескиванию кристалла, что делает его непригодным для кристаллографии. Как правило, успешные криоусловия определяются методом проб и ошибок.
Капилляр или петля устанавливаются на гониометре, что позволяет точно позиционировать его в рентгеновском пучке и вращать. Поскольку и кристалл, и пучок часто очень малы, кристалл должен быть центрирован в пучке с точностью ~25 микрометров, чему способствует камера, сфокусированная на кристалле. Наиболее распространенным типом гониометра является «каппа-гониометр», который предлагает три угла вращения: угол ω, который вращается вокруг оси, перпендикулярной пучку; угол κ, вокруг оси под углом ~50° к оси ω; и, наконец, угол φ вокруг оси петли/капилляра. Когда угол κ равен нулю, оси ω и φ совмещены. Вращение κ обеспечивает удобную установку кристалла, поскольку рычаг, в котором установлен кристалл, может быть повернут в сторону кристаллографа. Колебания, выполняемые во время сбора данных (упомянутые ниже), включают только ось ω. Более старым типом гониометра является четырехкружный гониометр и его родственники, такие как шестикружный гониометр.
Запись размышлений
Относительная интенсивность отражений дает информацию для определения расположения молекул внутри кристалла в атомных деталях. Интенсивность этих отражений может быть зарегистрирована с помощью фотопленки, детектора площади (например, пиксельного детектора) или датчика изображения с зарядовой связью (ПЗС). Пики при малых углах соответствуют данным с низким разрешением, тогда как при больших углах представляют данные с высоким разрешением; таким образом, верхний предел возможного разрешения структуры может быть определен из первых нескольких изображений. На этом этапе можно определить некоторые показатели качества дифракции, такие как мозаичность кристалла и его общий беспорядок, наблюдаемые в ширинах пиков. Некоторые патологии кристалла, которые сделали бы его непригодным для решения структуры, также можно быстро диагностировать на этом этапе.
Одного набора пятен недостаточно для реконструкции всего кристалла; он представляет собой лишь небольшой срез полного трехмерного набора. Чтобы собрать всю необходимую информацию, кристалл необходимо вращать шаг за шагом на 180°, записывая изображение на каждом шаге; на самом деле, для покрытия обратного пространства требуется немного больше 180° из-за кривизны сферы Эвальда. Однако, если кристалл имеет более высокую симметрию, может быть записан меньший угловой диапазон, такой как 90° или 45°. Ось вращения следует изменить по крайней мере один раз, чтобы избежать образования «слепого пятна» в обратном пространстве вблизи оси вращения. Обычно кристалл слегка покачивают (на 0,5–2°), чтобы захватить более широкую область обратного пространства.
Для некоторых методов фазирования может потребоваться несколько наборов данных. Например, многоволновое аномальное дисперсионное фазирование требует, чтобы рассеяние регистрировалось по крайней мере на трех (а обычно на четырех, для избыточности) длинах волн входящего рентгеновского излучения. Один кристалл может слишком сильно деградировать во время сбора одного набора данных из-за радиационного повреждения; в таких случаях необходимо брать наборы данных на нескольких кристаллах.
Симметрия кристалла, элементарная ячейка и масштабирование изображения
Записанная серия двумерных дифракционных картин, каждая из которых соответствует различной ориентации кристалла, преобразуется в трехмерный набор. Обработка данных начинается с индексации отражений. Это означает определение размеров элементарной ячейки и того, какой пик изображения соответствует какой позиции в обратном пространстве. Побочным продуктом индексации является определение симметрии кристалла, т. е. его пространственной группы. Некоторые пространственные группы могут быть исключены с самого начала. Например, симметрии отражения не могут наблюдаться в хиральных молекулах; таким образом, для молекул белка, которые почти всегда хиральны, разрешено только 65 пространственных групп из 230 возможных. Индексация обычно выполняется с использованием процедуры автоиндексации. После назначения симметрии данные затем интегрируются. Это преобразует сотни изображений, содержащих тысячи отражений, в один файл, состоящий из (как минимум) записей индекса Миллера каждого отражения и интенсивности для каждого отражения (в этом состоянии файл часто также включает оценки ошибок и меры частичности (какая часть данного отражения была записана на этом изображении)).
Полный набор данных может состоять из сотен отдельных изображений, сделанных при разных ориентациях кристалла. Их необходимо объединить и масштабировать, используя пики, отображаемые на двух или более изображениях (объединение), и масштабировать, чтобы получить согласованную шкалу интенсивности. Оптимизация шкалы интенсивности имеет решающее значение, поскольку относительная интенсивность пиков является ключевой информацией, на основе которой определяется структура. Повторяющийся метод сбора кристаллографических данных и часто высокая симметрия кристаллических материалов заставляют дифрактометр несколько раз регистрировать множество эквивалентных по симметрии отражений. Это позволяет рассчитать R-фактор, связанный с симметрией, индекс надежности, основанный на том, насколько схожи измеренные интенсивности эквивалентных по симметрии отражений, [необходимы пояснения], таким образом оценивая качество данных.
Начальная фазировка
Интенсивность каждого дифракционного «пятна» пропорциональна квадрату модуля структурного фактора. Структурный фактор — это комплексное число, содержащее информацию, касающуюся как амплитуды, так и фазы волны. Для того чтобы получить интерпретируемую карту электронной плотности, должны быть известны как амплитуда, так и фаза (карта электронной плотности позволяет кристаллографу построить начальную модель молекулы). Фазу нельзя напрямую записать во время дифракционного эксперимента: это известно как проблема фазы. Начальные оценки фазы можно получить различными способами:
Построение модели и уточнение фаз
Получив начальные фазы, можно построить начальную модель. Атомные позиции в модели и соответствующие им факторы Дебая-Валлера (или B-факторы, учитывающие тепловое движение атома) можно уточнить для соответствия наблюдаемым данным дифракции, в идеале получая лучший набор фаз. Затем можно подогнать новую модель к новой карте электронной плотности и выполнить последовательные раунды уточнения. Этот итеративный процесс продолжается до тех пор, пока корреляция между данными дифракции и моделью не будет максимизирована. Согласие измеряется с помощью R-фактора, определяемого как
где F — структурный фактор. Похожий критерий качества — Rfree, который рассчитывается по подмножеству (~10%) отражений, которые не были включены в уточнение структуры. Оба фактора R зависят от разрешения данных. Как правило, Rfree должен быть приблизительно равен разрешению в ангстремах, деленному на 10; таким образом, набор данных с разрешением 2 Å должен давать окончательное Rfree ~ 0,2. Характеристики химических связей, такие как стереохимия, водородные связи и распределение длин связей и углов, являются дополнительными мерами качества модели. При итеративном построении моделей часто встречаются смещение фазы или смещение модели: поскольку оценки фазы исходят из модели, каждый раунд вычисленной карты имеет тенденцию показывать плотность везде, где модель имеет плотность, независимо от того, есть ли на самом деле плотность. Эту проблему можно смягчить, используя взвешивание по методу максимального правдоподобия и проверку с использованием карт пропуска.
Может оказаться невозможным наблюдать каждый атом в асимметричной единице. Во многих случаях кристаллографический беспорядок размывает карту электронной плотности. Слабо рассеивающие атомы, такие как водород, обычно невидимы. Также возможно, что один атом появляется несколько раз на карте электронной плотности, например, если боковая цепь белка имеет несколько (<4) разрешенных конформаций. В других случаях кристаллограф может обнаружить, что ковалентная структура, выведенная для молекулы, была неправильной или измененной. Например, белки могут расщепляться или подвергаться посттрансляционным модификациям, которые не были обнаружены до кристаллизации.
Расстройство
Распространенной проблемой уточнения кристаллических структур является кристаллографический беспорядок. Расстройство может принимать разные формы, но обычно предполагает сосуществование двух или более видов или конформаций. Неспособность распознать расстройство приводит к ошибочной интерпретации. Ловушки неправильного моделирования беспорядка иллюстрируются отвергнутой гипотезой изомерии растяжения связей. Беспорядок моделируется с учетом относительной численности компонентов, часто только двух, и их идентичности. В структурах крупных молекул и ионов растворитель и противоионы часто неупорядочены.
Прикладной вычислительный анализ данных
Использование вычислительных методов для анализа данных порошковой рентгеновской дифракции теперь обобщено. Обычно он сравнивает экспериментальные данные с смоделированной дифрактограммой модельной структуры, принимая во внимание инструментальные параметры, и уточняет структурные или микроструктурные параметры модели с использованием алгоритма минимизации на основе наименьших квадратов. Большинство доступных инструментов, позволяющих идентифицировать фазы и уточнять структуру, основаны на методе Ритвельда, некоторые из них являются открытым и бесплатным программным обеспечением, таким как FullProf Suite, Jana2006, MAUD, Rietan, GSAS и т. д., в то время как другие доступны по коммерческим лицензиям, таким как Diffrac.Suite TOPAS, Match! и т. д. Большинство этих инструментов также допускают уточнение по Ле Бейлю (также называемое сопоставлением профилей), то есть уточнение параметров ячейки на основе положений пиков Брэгга и профилей пиков, без учета кристаллографической структуры как таковой. Более современные инструменты позволяют уточнять как структурные, так и микроструктурные данные, например, программа FAULTS, включенная в пакет FullProf Suite, которая позволяет уточнять структуры с планарными дефектами (например, дефекты упаковки, двойникования, срастания).
Нанесение структуры
После завершения разработки модели структуры молекулы ее часто помещают в кристаллографическую базу данных, такую как Кембриджская структурная база данных (для малых молекул), База данных неорганической кристаллической структуры (ICSD) (для неорганических соединений) или Банк данных белков ( для белка и иногда нуклеиновых кислот). Многие структуры, полученные в частных коммерческих предприятиях для кристаллизации белков, имеющих медицинское значение, не депонируются в общедоступных кристаллографических базах данных.
Вклад женщин в рентгеновскую кристаллографию
Ряд женщин были пионерами рентгеновской кристаллографии в то время, когда они были исключены из большинства других разделов физической науки.
Кэтлин Лонсдейл была аспиранткой Уильяма Генри Брэгга, у которого было 11 женщин-учениц из 18. Она известна как своими экспериментальными, так и теоретическими работами. Лонсдейл присоединилась к его исследовательской группе по кристаллографии в Королевском институте в Лондоне в 1923 году, а после замужества и рождения детей вернулась к работе с Брэггом в качестве исследователя. Она подтвердила структуру бензольного кольца, провела исследования алмаза, была одной из первых двух женщин, избранных в Королевское общество в 1945 году, а в 1949 году была назначена первой женщиной-штатным профессором химии и заведующей кафедрой кристаллографии в Университетском колледже Лондона. Лонсдейл всегда выступал за более широкое участие женщин в науке и сказал в 1970 году: «Любая страна, которая хочет в полной мере использовать всех своих потенциальных ученых и технологов, может это сделать, но она не должна ожидать, что получит женщин так же просто, как она получает мужчин. … Тогда было бы утопией предполагать, что любая страна, которая действительно хочет, чтобы замужние женщины вернулись к научной карьере, когда ее дети больше не нуждаются в ее физическом присутствии, должна принять специальные меры, чтобы побудить ее сделать это?». В этот период Лонсдейл начал сотрудничать с Уильямом Т. Эстбери над набором из 230 таблиц пространственных групп, который был опубликован в 1924 году и стал важнейшим инструментом для кристаллографов.
В 1932 году Дороти Ходжкин присоединилась к лаборатории физика Джона Десмонда Бернала, бывшего студента Брэгга, в Кембридже, Великобритания. Они с Берналом сделали первые рентгеновские фотографии кристаллических белков. Ходжкин также сыграла роль в основании Международного союза кристаллографии. Она была удостоена Нобелевской премии по химии в 1964 году за свою работу с использованием рентгеновских методов для изучения структур пенициллина, инсулина и витамина B12. Ее работа над пенициллином началась в 1942 году во время войны, а над витамином B12 — в 1948 году. Хотя ее группа медленно росла, их основное внимание было сосредоточено на рентгеновском анализе натуральных продуктов. Она является единственной британской женщиной, когда-либо получившей Нобелевскую премию по научной теме.
Розалинда Франклин сделала рентгеновскую фотографию волокна ДНК, которая оказалась ключом к открытию Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком двойной спирали, за что они оба получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1962 году. Уотсон рассказал об этом в своем автобиографическом отчете. открытие структуры ДНК, Двойная спираль, что он использовал рентгеновскую фотографию Франклина без ее разрешения. Франклин умерла от рака в возрасте 30 лет, еще до того, как Уотсон получила Нобелевскую премию. Франклин также провел важные структурные исследования углерода в угле и графите, а также вирусов растений и животных.
Изабелла Карле из Военно-морской исследовательской лаборатории США разработала экспериментальный подход к математической теории кристаллографии. Ее работа улучшила скорость и точность химического и биомедицинского анализа. Однако только ее муж Джером разделил Нобелевскую премию по химии 1985 года с Гербертом Хауптманом «за выдающиеся достижения в разработке прямых методов определения кристаллических структур». Другие организации, присуждающие награды, осыпали Изабеллу наградами по ее собственному праву.
Женщины написали множество учебников и исследовательских работ в области рентгеновской кристаллографии. В течение многих лет Лонсдейл редактировала Международные таблицы по кристаллографии, которые предоставляют информацию о кристаллических решетках, симметрии и пространственных группах, а также математические, физические и химические данные о структурах. Ольга Кеннард из Кембриджского университета основала и руководила Кембриджским центром кристаллографических данных, международно признанным источником структурных данных о малых молекулах, с 1965 по 1997 год. Дженни Пикворт Глускер, британский ученый, была соавтором книги Анализ структуры кристаллов: учебник, впервые опубликованной в 1971 году и в третьем издании в 2010 году. Элинор Додсон, австралийский биолог, которая начинала как техник Дороти Ходжкин, была главным инициатором CCP4, проекта совместных вычислений, который в настоящее время делится более чем 250 программными инструментами с кристаллографами белков по всему миру.