Поли(амидоамин), или ПАМАМ, представляет собой класс дендримеров, которые состоят из повторяющихся разветвленных субъединиц амидной и аминной функциональности. Дендримеры ПАМАМ, иногда называемые торговым наименованием Starburst, были тщательно изучены с момента их синтеза в 1985 году и представляют собой наиболее хорошо охарактеризованное семейство дендримеров, а также первое, которое было коммерциализировано. Как и другие дендримеры, ПАМАМ имеют в целом сферическую форму и характеризуются внутренней молекулярной архитектурой, состоящей из древовидного разветвления, причем каждый внешний «слой» или поколение содержит экспоненциально больше точек разветвления. Эта разветвленная архитектура отличает ПАМАМ и другие дендримеры от традиционных полимеров, поскольку она обеспечивает низкую полидисперсность и высокий уровень структурного контроля во время синтеза, а также приводит к образованию большого количества поверхностных участков относительно общего молекулярного объема. Более того, дендримеры PAMAM демонстрируют большую биосовместимость, чем другие семейства дендримеров, возможно, из-за комбинации поверхностных аминов и внутренних амидных связей; эти связующие мотивы очень напоминают врожденную биологическую химию и наделяют дендримеры PAMAM свойствами, аналогичными свойствам глобулярных белков. Относительная простота/низкая стоимость синтеза дендримеров PAMAM (особенно по сравнению с биологическими молекулами аналогичного размера, такими как белки и антитела), наряду с их биосовместимостью, структурным контролем и функционализируемостью, сделали PAMAM жизнеспособными кандидатами для применения в разработке лекарств, биохимии и нанотехнологиях.
Синтез
Дивергентный синтез
Дивергентный синтез относится к последовательному «росту» дендримера слой за слоем, начиная с основной молекулы «инициатора», которая содержит функциональные группы, способные действовать как активные центры в начальной реакции. Каждая последующая реакция в серии увеличивает количество доступных поверхностных групп экспоненциально. Основные молекулы, которые дают начало дендримерам ПАМАМ, могут различаться, но наиболее простыми инициаторами являются аммиак и этилендиамин. Внешний рост дендримеров ПАМАМ осуществляется путем чередования двух реакций:
Каждый раунд реакций формирует новое «поколение», и дендримеры ПАМАМ часто классифицируются по номеру поколения; общепринятое сокращение для этой классификации — «GX» или «GX PAMAM», где X — это число, указывающее номер поколения. Первый полный цикл присоединения Михаэля, за которым следует сочетание с этилендиамином, формирует поколение 0 ПАМАМ, с последующими добавлениями Михаэля, дающими начало «половинным» поколениям, и последующим сочетанием амида, дающим начало «полным» (целым) поколениям.
При дивергентном синтезе дендримеров крайне важно позволить каждой реакции дойти до конца; любые дефекты, вызванные неполной реакцией или внутримолекулярной связью новых поверхностных аминов с непрореагировавшими метилэфирными поверхностными группами, могут привести к «запаздывающим» поколениям, останавливая дальнейший рост определенных ветвей. Эти примеси трудно удалить при использовании дивергентного синтетического подхода, поскольку молекулярная масса, физический размер и химические свойства дефектных дендримеров по своей природе очень похожи на желаемый продукт. По мере увеличения числа поколений становится все труднее производить чистые продукты своевременно из-за стерических ограничений. В результате синтез дендримеров ПАМАМ более высокого поколения может занять месяцы.
Конвергентный синтез
Конвергентный синтез дендримера начинается с того, что в конечном итоге станет поверхностью дендримера, и продолжается внутрь. Конвергентный синтетический подход использует ортогональные защитные группы (две защитные группы, условия снятия защиты которых не удаляют друг друга); это дополнительное соображение, отсутствующее при использовании дивергентного подхода. На рисунке ниже изображена общая схема для конвергентного синтетического подхода.
Конвергентный синтез, как показано выше, начинается с дендритной субъединицы, состоящей из реактивной «фокусной группы» A и разветвленной группы B (B может быть многократно разветвленным в самом обобщенном сценарии, но PAMAMs разделяются только один раз в каждой точке разветвления). Сначала A ортогонально защищен и отложен для дальнейших реакций. B также ортогонально защищен, оставляя незащищенную A на этой молекуле для соединения с каждой из незащищенных групп B из исходного соединения. Это приводит к новому виду более высокого поколения, который защищен как на A, так и на B. Избирательное снятие защиты с A дает новую молекулу, которая снова может быть связана с исходным мономером, таким образом формируя еще одно новое поколение. Затем этот процесс можно повторять для формирования все большего количества слоев.
Токсичность
В пробирке
Установлено, что катионные макромолекулы в целом дестабилизируют клеточную мембрану, что может привести к лизису и гибели клетки. Общий вывод, представленный в текущей работе, перекликается с этим наблюдением: увеличение молекулярной массы дендримера и поверхностного заряда (оба зависят от поколения) увеличивает их цитотоксическое поведение.
Первоначальные исследования токсичности ПАМАМ показали, что ПАМАМ менее токсичен (в некоторых случаях гораздо менее), чем родственные дендримеры, демонстрируя минимальную цитотоксичность в ходе множественных скринингов токсичности, включая тесты метаболической активности (анализ МТТ), клеточного распада (анализ ЛДГ) и морфологии ядра (окрашивание DAPI). Однако в других клеточных линиях анализ МТТ и несколько других анализов выявили некоторую цитотоксичность. Эти разрозненные наблюдения могут быть связаны с различиями в чувствительности различных клеточных линий, использованных в каждом исследовании, к ПАМАМ; хотя цитотоксичность для ПАМАМ различается между клеточными линиями, они остаются менее токсичными, чем другие семейства дендримеров в целом.
Совсем недавно серия исследований Mukherjee et al. пролили некоторый свет на механизм цитотоксичности ПАМАМ, предоставив доказательства того, что дендримеры вырываются из своей инкапсулирующей мембраны (эндосомы) после поглощения клеткой, вызывая повреждение митохондрий клетки и в конечном итоге приводя к гибели клетки. Дальнейшее выяснение механизма цитотоксичности ПАМАМ поможет разрешить спор о том, насколько именно токсичны дендримеры.
В отношении нейрональной токсичности было показано, что четвертое поколение PAMAM разрушает кальциевые транзиенты, изменяя динамику везикул нейротрансмиттера и синаптическую передачу. Все вышеперечисленное можно предотвратить, заменив поверхностные амины фолатом или полиэтиленгликолем.
Также было показано, что дендримеры ПАМАМ вызывают разрыв эритроцитов или гемолиз. Таким образом, если дендримеры ПАМАМ следует рассматривать в биологических приложениях, в которых дендримеры или комплексы дендримеров перемещаются по кровотоку, следует учитывать концентрацию и количество поколений немодифицированного ПАМАМ в кровотоке.
В естественных условиях
На сегодняшний день было проведено мало углубленных исследований поведения дендримеров ПАМАМ in vivo. Это может быть отчасти связано с различным поведением ПАМАМ в зависимости от модификации поверхности (см. ниже), что делает характеристику их свойств in vivo в значительной степени зависящей от случая. Тем не менее, судьба и транспорт немодифицированных дендримеров ПАМАМ является важным исследованием случая, поскольку любые биологические приложения могут включать немодифицированный ПАМАМ в качестве побочного продукта метаболизма. В единственном крупном систематическом исследовании поведения ПАМАМ in vivo инъекции высоких уровней чистых ПАМАМ в течение длительных периодов времени мышам не показали никаких признаков токсичности вплоть до ПАМАМ G5, а для ПАМАМ G3-G7 наблюдалась низкая иммуногенность. Эти наблюдения на системном уровне, по-видимому, согласуются с наблюдением, что дендримеры ПАМАМ в целом не являются чрезвычайно цитотоксичными; Однако необходимы более глубокие исследования фармакокинетики и биораспределения ПАМАМ, прежде чем можно будет перейти к его применению in vivo.
Модификация поверхности
Одним из уникальных свойств дендримеров, таких как PAMAM, является высокая плотность поверхностных функциональных групп, которые позволяют вносить множество изменений в поверхность каждой молекулы дендримера. В предполагаемых дендримерах PAMAM поверхность изобилует первичными аминами, причем более высокие поколения выражают экспоненциально большую плотность аминогрупп. Хотя потенциал присоединения множества вещей к каждому дендримеру является одним из их самых больших преимуществ, наличие высоко локализованных положительных зарядов может быть токсичным для клеток. Модификация поверхности посредством присоединения ацетильных и лауроильных групп помогает маскировать эти положительные заряды, ослабляя цитотоксичность и увеличивая проницаемость для клеток. Таким образом, эти типы модификаций особенно полезны для биологических приложений. Также обнаружено, что вторичные и третичные аминогруппы на поверхности менее токсичны, чем первичные аминогруппы на поверхности, что позволяет предположить, что именно экранирование заряда имеет основное влияние на цитотоксичность, а не какой-то вторичный эффект от конкретной функциональной группы. Кроме того, другие исследования указывают на тонкий баланс в заряде, который должен быть достигнут для получения минимальной цитотоксичности. Гидрофобные взаимодействия также могут вызывать лизис клеток, а дендримеры ПАМАМ, поверхности которых насыщены неполярными модификациями, такими как липиды или полиэтиленгликоль (ПЭГ), страдают от более высокой цитотоксичности, чем их частично замещенные аналоги. Было также показано, что дендримеры ПАМАМ с неполярными внутренними компонентами вызывают гемолиз.
Приложения
Приложения с участием дендримеров в целом используют либо заполнение груза во внутреннюю часть дендримера (иногда называемую «дендритной коробкой»), либо присоединение груза к поверхности дендримера. Приложения дендримеров PAMAM, как правило, сосредоточены на модификации поверхности, используя преимущества как электростатических, так и ковалентных методов для связывания груза. В настоящее время основные области исследований с использованием дендримеров PAMAM и их функционализированных производных включают доставку лекарств и доставку генов.
Доставка наркотиков
Поскольку дендримеры PAMAM продемонстрировали способность проникновения в широкий спектр клеточных линий, простые комплексы PAMAM-лекарство будут влиять на широкий спектр клеток при введении в живую систему. Таким образом, для селективного проникновения в типы клеток требуются дополнительные лиганды таргетинга. Например, PAMAM, дериватизированный фолиевой кислотой, предпочтительно поглощается раковыми клетками, которые, как известно, сверхэкспрессируют фолатный рецептор на своей поверхности. Присоединение дополнительных методов лечения вместе с фолиевой кислотой, таких как изотопы бора, цисплатин и метотрексат, оказалось весьма эффективным. В будущем, по мере того как синтетический контроль над химией поверхности дендримеров станет более надежным, PAMAM и другие семейства дендримеров могут занять видное место наряду с другими основными подходами к таргетной терапии рака.
В исследовании функционализированного фолиевой кислотой ПАМАМ метотрексат был объединен либо как комплекс включения в дендример, либо как ковалентное поверхностное присоединение. В случае комплекса включения лекарство высвобождалось из внутренней части дендримера почти немедленно при воздействии биологических условий и действовало аналогично свободному лекарству. Подход с поверхностным присоединением дал стабильные растворимые комплексы, которые были способны избирательно воздействовать на раковые клетки и не высвобождали преждевременно свой груз. Высвобождение лекарства в случае комплекса включения можно объяснить протонированием поверхностных и внутренних аминов в биологических условиях, что приводит к распаковке конформации дендримера и последующему высвобождению внутреннего груза. Аналогичное явление наблюдалось с комплексами ПАМАМ и цисплатина.
Дендримеры PAMAM также продемонстрировали внутренние свойства лекарственных средств. Одним из весьма примечательных примеров является способность дендримеров PAMAM удалять агрегаты прионных белков, смертельные белковые агрегаты, ответственные за губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота («коровье бешенство») и болезнь Крейтцфельдта-Якоба у людей. Растворение прионов объясняется поликатионной и дендримерной природой PAMAM, причем наиболее эффективными являются дендримеры более высокого поколения (>G3); гидроксиконцевые PAMAM, а также линейные полимеры показали небольшой эффект или вообще не показали его. Поскольку нет других известных соединений, способных растворять прионы, которые уже агрегировали, дендримеры PAMAM дали небольшую передышку в изучении таких смертельных заболеваний и могут дать дополнительное представление о механизме образования прионов.
Генная терапия
Открытие того, что наличие положительного заряда на поверхности дендримеров PAMAM снижает их цитотоксичность, имеет интересные последствия для применений трансфекции ДНК. Поскольку клеточная мембрана имеет отрицательно заряженную внешнюю поверхность, а фосфатный остов ДНК также заряжен отрицательно, трансфекция свободной ДНК не очень эффективна просто из-за отталкивания заряда. Однако было бы разумно ожидать заряженных взаимодействий между анионным фосфатным остовом ДНК и поверхностными группами ПАМАМ-дендримеров с концевыми аминогруппами, которые положительно ионизированы в физиологических условиях. Это может привести к образованию комплекса ПАМАМ-ДНК, который сделает трансфекцию ДНК более эффективной за счет нейтрализации зарядов на обоих элементах, в то время как цитотоксичность дендримера ПАМАМ также будет снижена. Действительно, несколько отчетов подтвердили, что дендримеры PAMAM являются эффективными агентами трансфекции ДНК.
Когда зарядовый баланс между фосфатами ДНК и поверхностными аминами ПАМАМ слегка положительный, достигается максимальная эффективность трансфекции; это открытие подтверждает идею о том, что комплекс связывается с поверхностью клетки посредством зарядовых взаимодействий. Поразительным наблюдением является то, что «активация» ПАМАМ путем частичной деградации посредством гидролиза повышает эффективность трансфекции на 2-3 порядка, что является дополнительным доказательством, подтверждающим существование электростатически связанного комплекса. Предполагается, что фрагментация некоторых ветвей дендримера ослабляет общую структуру (меньше амидных связей и пространственных ограничений), что теоретически может привести к лучшему контакту между дендримером и субстратом ДНК, поскольку дендример не вынужден принимать жесткую сферическую конформацию из-за стерических условий. Это, в свою очередь, приводит к более компактным комплексам ДНК, которые легче эндоцитируются. После эндоцитоза комплексы подвергаются воздействию кислых условий клеточной эндосомы. Дендримеры PAMAM действуют как буфер в этой среде, впитывая избыточные протоны с множеством остатков аминов, что приводит к ингибированию pH-зависимой эндосомальной нуклеазной активности и, таким образом, защищает ДНК груза. Третичные амины внутри дендримера также могут участвовать в буферной активности, заставляя молекулу раздуваться; кроме того, по мере того, как PAMAM принимают все больше и больше положительного заряда, их требуется меньше для оптимального взаимодействия PAMAM-ДНК, и свободные дендримеры высвобождаются из комплекса. Высвобождение и набухание дендримера может в конечном итоге привести к лизации эндосомы, что приведет к высвобождению ДНК груза. Активированные дендримеры PAMAM имеют меньший пространственный барьер для протонирования внутреннего амина, что, как полагают, является основным источником их преимущества перед неактивированным PAMAM.
В контексте существующих подходов к переносу генов дендримеры PAMAM занимают прочную позицию по отношению к основным классическим технологиям, таким как электропорация, микроинъекция и вирусные методы. Электропорация, которая включает в себя импульсное электричество через клетки для создания отверстий в мембране, через которые может проникать ДНК, имеет очевидные цитотоксические эффекты и не подходит для применения in vivo. С другой стороны, микроинъекция, использование тонких игл для физического введения генетического материала в ядро клетки, обеспечивает больший контроль, но является высококвалифицированной, скрупулезной задачей, в ходе которой можно трансфицировать относительно небольшое количество клеток. Хотя вирусные векторы могут обеспечить высокоспецифичную, высокоэффективную трансфекцию, создание таких вирусов является дорогостоящим и трудоемким; кроме того, присущая вирусная природа переноса генов часто вызывает иммунный ответ, тем самым ограничивая применение in vivo. Фактически, многие современные технологии трансфекции основаны на искусственно собранных липосомах (и липосомы, и ПАМАМы являются положительно заряженными макромолекулами). Поскольку дендримеры ПАМАМ и их комплексы с ДНК демонстрируют низкую цитотоксичность, более высокую эффективность трансфекции, чем методы на основе липосом, и эффективны в широком диапазоне клеточных линий, они заняли важное место в современных методологиях генной терапии. Биотехнологическая компания Qiagen в настоящее время предлагает две линейки продуктов для трансфекции ДНК (SuperFect и PolyFect), основанные на технологии активированных дендримеров ПАМАМ.
Много работы еще предстоит сделать, прежде чем активированные дендримеры PAMAM можно будет использовать в качестве in vivo генных терапевтических агентов. Хотя дендримеры оказались высокоэффективными и нетоксичными in vitro, стабильность, поведение и транспорт трансфекционного комплекса в биологических системах еще предстоит охарактеризовать и оптимизировать. Как и в случае с приложениями по доставке лекарств, специфическое нацеливание трансфекционного комплекса является идеальным и также должно быть изучено.