Комбинаторная химия включает в себя методы химического синтеза, которые позволяют приготовить большое количество (десятки, тысячи или даже миллионы) соединений в одном процессе. Эти библиотеки соединений могут быть созданы как смеси, наборы отдельных соединений или химические структуры, созданные с помощью компьютерного программного обеспечения. Комбинаторная химия может быть использована для синтеза малых молекул и пептидов.
Стратегии, которые позволяют идентифицировать полезные компоненты библиотек, также являются частью комбинаторной химии. Методы, используемые в комбинаторной химии, применяются и за пределами химии.
Введение
Основной принцип комбинаторной химии заключается в подготовке библиотек очень большого числа соединений и выявлении тех, которые полезны в качестве потенциальных лекарств или агрохимикатов. Это основано на высокопроизводительном скрининге, который способен оценить выход в достаточном масштабе.
Хотя комбинаторная химия действительно была принята промышленностью только с 1990-х годов, ее корни можно увидеть еще в 1960-х годах, когда исследователь из Рокфеллеровского университета Брюс Меррифилд начал изучать твердофазный синтез пептидов. Синтез пептидов комбинаторным способом быстро приводит к большому количеству молекул. Использование двадцати природных аминокислот, например, в трипептиде создает 8000 (203) возможностей. Позднее были введены твердофазные методы для малых молекул, и Фурка разработал подход «разделения и смешивания»
В своей современной форме комбинаторная химия, вероятно, оказала наибольшее влияние на фармацевтическую промышленность. Исследователи, пытающиеся оптимизировать профиль активности соединения, создают «библиотеку» из множества различных, но связанных соединений. Достижения в области робототехники привели к промышленному подходу к комбинаторному синтезу, что позволяет компаниям регулярно производить более 100 000 новых и уникальных соединений в год.
Чтобы справиться с огромным количеством структурных возможностей, исследователи часто создают «виртуальную библиотеку», вычислительное перечисление всех возможных структур данного фармакофора со всеми доступными реагентами. Такая библиотека может состоять из тысяч или миллионов «виртуальных» соединений. Исследователь выберет подмножество «виртуальной библиотеки» для фактического синтеза, основываясь на различных расчетах и критериях (см. ADME, вычислительная химия и QSAR).
Полимеры (пептиды и олигонуклеотиды)
Комбинаторный сплит-микс (сплит и пул) синтез
Комбинаторный сплит-микс (сплит и пул) синтез основан на твердофазном синтезе, разработанном Меррифилдом. Если комбинаторная пептидная библиотека синтезируется с использованием 20 аминокислот (или других видов строительных блоков), то твердая подложка в форме шарика делится на 20 равных частей. Затем следует соединение различных аминокислот с каждой частью. Третий шаг — смешивание всех частей. Эти три шага составляют цикл. Удлинение пептидных цепей может быть реализовано путем простого повторения шагов цикла.
Процедура проиллюстрирована синтезом библиотеки дипептидов с использованием тех же трех аминокислот в качестве строительных блоков в обоих циклах. Каждый компонент этой библиотеки содержит две аминокислоты, расположенные в разном порядке. Аминокислоты, используемые в связях, представлены на рисунке желтыми, синими и красными кругами. Расходящиеся стрелки показывают разделение твердой опорной смолы (зеленые круги) на равные части, вертикальные стрелки означают связь, а сходящиеся стрелки представляют смешивание и гомогенизацию частей опоры.
На рисунке показано, что в двух циклах синтеза образуется 9 дипептидов. В третьем и четвертом циклах образуется 27 трипептидов и 81 тетрапептид соответственно.
«Синтез сплит-микса» имеет несколько выдающихся особенностей:
В 1990 году три группы описали методы получения пептидных библиотек биологическими методами, а год спустя Фодор и др. опубликовали замечательный метод синтеза пептидных массивов на небольших предметных стеклах.
Метод «параллельного синтеза» был разработан Марио Гейзеном и его коллегами для приготовления пептидных массивов. Они синтезировали 96 пептидов на пластиковых стержнях (штырях), покрытых на концах твердой подложкой. Штыри были погружены в раствор реагентов, помещенных в лунки микротитрационного планшета. Метод широко применяется, особенно при использовании автоматических параллельных синтезаторов. Хотя параллельный метод намного медленнее настоящего комбинаторного, его преимущество в том, что точно известно, какой пептид или другое соединение образуется на каждом штыре.
Дальнейшие процедуры были разработаны для объединения преимуществ как метода сплит-микс, так и параллельного синтеза. В методе, описанном двумя группами, твердый носитель был заключен в проницаемые пластиковые капсулы вместе с радиочастотной меткой, которая содержала код соединения, которое должно было быть образовано в капсуле. Процедура была выполнена аналогично методу сплит-микс. Однако на этапе сплит капсулы были распределены по реакционным сосудам в соответствии с кодами, считанными с радиочастотных меток капсул.
Другой метод для той же цели был разработан Фуркой и соавторами и называется «синтез струн». В этом методе капсулы не несли никакого кода. Они нанизываются, как жемчужины в ожерелье, и помещаются в реакционные сосуды в виде струн. Идентичность капсул, а также их содержимое сохраняются в их положении, занимаемом на струнах. После каждого шага связывания капсулы перераспределяются между новыми струнами в соответствии с определенными правилами.
Малые молекулы
В процессе открытия лекарств синтез и биологическая оценка представляющих интерес малых молекул обычно были долгим и трудоемким процессом. Комбинаторная химия возникла в последние десятилетия как подход, позволяющий быстро и эффективно синтезировать большое количество потенциальных веществ.
Кандидаты в низкомолекулярные лекарства. В типичном синтезе в конце синтетической схемы образуется только одна целевая молекула, причем на каждом этапе синтеза образуется только один продукт. При комбинаторном синтезе, когда используется только один исходный материал, можно синтезировать большую библиотеку молекул, используя идентичные условия реакции, которые затем можно проверить на их биологическую активность. Этот пул продуктов затем разделяется на три равные части, содержащие каждый из трех продуктов, а затем каждый из трех отдельных пулов подвергается реакции с другой единицей реагента B, C или D, в результате чего из трех предыдущих получается 9 уникальных соединений. Затем этот процесс повторяется до тех пор, пока не будет добавлено желаемое количество строительных блоков, в результате чего образуется множество соединений. При синтезе библиотеки соединений путем многостадийного синтеза необходимо использовать эффективные методы реакции, и если после каждой стадии реакции используются традиционные методы очистки, пострадают выходы и эффективность.
Твердофазный синтез предлагает потенциальные решения, позволяющие избежать необходимости в типичных этапах гашения и очистки, часто используемых в синтетической химии. Как правило, исходная молекула прикрепляется к твердому носителю (обычно нерастворимому полимеру), затем проводятся дополнительные реакции, а конечный продукт очищается и затем отщепляется от твердого носителя. Поскольку интересующие молекулы прикреплены к твердому носителю, можно сократить очистку после каждой реакции до одного этапа фильтрации/промывки, устраняя необходимость в утомительных этапах экстракции жидкость-жидкость и испарения растворителя, которые предполагает большинство синтетических химий. Кроме того, используя гетерогенные реагенты, избыток реагентов может использоваться для завершения вялых реакций, что может дополнительно повысить выходы. Избыток реагентов можно просто смыть без необходимости дополнительных этапов очистки, таких как хроматография.
За прошедшие годы было разработано множество методов для усовершенствования использования твердофазного органического синтеза в комбинаторной химии, включая усилия по повышению простоты синтеза и очистки, а также нетрадиционные методы для характеристики промежуточных продуктов. Хотя
большинство примеров, описанных здесь, будут использовать гетерогенные реакционные среды на каждом этапе реакции, Бут и Ходжес приводят ранний пример использования реагентов на твердой подложке только на этапе очистки традиционных синтезов в фазе раствора. По их мнению,
химия в фазе раствора предлагает преимущества, заключающиеся в избежании реакций присоединения и расщепления, необходимых для закрепления и удаления молекул на смолах, а также в устранении необходимости воссоздания твердофазных аналогов устоявшихся реакций в фазе раствора.
Один этап очистки в конце синтеза позволяет удалить одну или несколько примесей, предполагая, что химическая структура примеси известна. Хотя использование реагентов на твердой подложке значительно упрощает синтез соединений, многие комбинаторные синтезы требуют нескольких этапов, каждый из которых все еще требует некоторой формы очистки. Армстронг и др. описывают однореакторный метод создания комбинаторных библиотек, называемых многокомпонентными конденсациями (MCC). В этой схеме три или более реагентов реагируют таким образом, что каждый реагент включается в конечный продукт за один этап, что устраняет необходимость в многоэтапном синтезе, который включает много этапов очистки. В MCC не требуется деконволюция для определения того, какие соединения являются биологически активными, поскольку каждый синтез в массиве имеет только один продукт, поэтому идентичность соединения должна быть однозначно известна.
В другом синтезе массива Стилл создал большую библиотеку олигопептидов путем расщепленного синтеза. Недостатком создания многих тысяч соединений является то, что сложно определить структуру образованных соединений. Их решение заключается в использовании молекулярных меток, где крошечное количество (1 пмоль/бусина) красителя прикреплено к бусинам, и идентичность определенной бусины может быть определена путем анализа того, какие метки присутствуют на бусине. Несмотря на то, насколько легко прикрепление меток делает идентификацию рецепторов, было бы совершенно невозможно индивидуально проверить каждое соединение на его способность связывать рецепторы, поэтому краситель был прикреплен к каждому рецептору, так что только те рецепторы, которые связываются со своим субстратом, производят изменение цвета.
Когда необходимо запустить много реакций в массиве (например, 96 реакций, описанных в одном из массивов MCC Armstrong), некоторые из наиболее утомительных аспектов синтеза можно автоматизировать для повышения эффективности. Эта работа, «метод DIVERSOMER», была впервые применена в Parke-Davis в начале 1990-х годов для запуска до 40 химических реакций параллельно. Эти усилия привели к появлению первого коммерчески доступного оборудования для комбинаторной химии (синтезатор Diversomer, проданный Chemglass) и первому использованию робототехники для обработки жидкостей в химической лаборатории. Этот метод использует устройство, которое автоматизирует циклы загрузки и промывки смолы, а также мониторинг и очистку цикла реакции, и демонстрирует осуществимость их метода и аппарата, используя его для синтеза различных классов молекул, таких как гидантоины и бензодиазепины, запуская 8 или 40 отдельных реакций параллельно. Эта и несколько других новаторских работ в области комбинаторной химии были представлены как «классические» работы в этой области в 1999 году.
Часто невозможно использовать дорогостоящее оборудование, и Швабахер и др. описывают простой метод объединения параллельного синтеза членов библиотеки и оценки целых библиотек соединений. В их методе нить, разделенная на различные области, оборачивается вокруг цилиндра, где затем другой реагент соединяется с каждой областью, которая несет только один вид. Затем нить снова разделяется и оборачивается вокруг цилиндра другого размера, и этот процесс затем повторяется. Прелесть этого метода в том, что идентичность каждого продукта может быть определена просто по его местоположению вдоль нити, а соответствующая биологическая активность определяется с помощью преобразования Фурье сигналов флуоресценции.
В большинстве описанных здесь синтезов необходимо прикрепить и удалить исходный реагент к твердой подложке или удалить ее с нее. Это может привести к образованию гидроксильной группы, которая потенциально может повлиять на биологическую активность целевого соединения. Эллман использует твердофазные носители в схеме многостадийного синтеза для получения 192 отдельных производных 1,4-бензодиазепина, которые являются хорошо известными терапевтическими агентами. Чтобы исключить возможность потенциального взаимодействия гидроксильных групп, используется новый метод с использованием силилариловой химии для связывания молекул с твердой подложкой, которая отщепляется от подложки и не оставляет следов линкера.
При закреплении молекулы на твердом носителе промежуточные продукты не могут быть изолированы друг от друга без отщепления молекулы от смолы. Поскольку многие традиционные методы характеризации, используемые для отслеживания хода реакции и подтверждения структуры продукта, основаны на растворе, необходимо использовать разные методы. Для подтверждения структуры и мониторинга хода твердофазных реакций использовались 13 C ЯМР-спектроскопия в гель-фазе, масс-спектрометрия MALDI и ИК-спектроскопия. Гордон и др. описывают несколько тематических исследований, в которых для создания комбинаторных библиотек малых молекул используются имины и пептидилфосфонаты. Для создания библиотеки иминов аминокислота, связанная со смолой, реагирует в присутствии альдегида. Авторы демонстрируют использование быстрой 13 C ЯМР-спектроскопии в гель-фазе и 1 H ЯМР-спектроскопии с вращением под магическим углом для мониторинга хода реакций и показали, что большинство иминов можно образовать всего за 10 минут при комнатной температуре, если в качестве растворителя использовать триметилортоформиат. Образовавшиеся имины затем были дериватизированы с получением 4-тиазолидинонов, B-лактамов и пирролидинов.
Использование твердофазных носителей значительно упрощает синтез больших комбинаторных библиотек соединений. Это делается путем закрепления исходного материала на твердом носителе и последующего проведения последующих реакций до тех пор, пока не будет создана достаточно большая библиотека, после чего продукты отщепляются от носителя. Использование твердофазной очистки также было продемонстрировано для использования в схемах синтеза в фазе раствора в сочетании со стандартными методами очистки экстракцией жидкость-жидкость.
Деконволюция и скрининг
Комбинаторные библиотеки
Комбинаторные библиотеки — это специальные многокомпонентные смеси низкомолекулярных химических соединений, которые синтезируются в одном поэтапном процессе. Они отличаются как от набора отдельных соединений, так и от серий соединений, полученных параллельным синтезом.
Важной особенностью является то, что в их синтезе используются смеси. Использование смесей обеспечивает очень высокую эффективность процесса. Оба реагента могут быть смесями, и в этом случае процедура будет еще более эффективной. Однако по практическим причинам целесообразно использовать метод сплит-микс, в котором одна из двух смесей заменяется отдельными строительными блоками (ББ). Смеси настолько важны, что не существует комбинаторных библиотек без использования смеси в синтезе, и если смесь используется в процессе, неизбежно образуются комбинаторные библиотеки. Синтез сплит-микс обычно реализуется с использованием твердого носителя, но его можно применять и в растворе. Поскольку структуры компонентов неизвестны, при скрининге необходимо использовать методы деконволюции.
Одной из важнейших особенностей комбинаторных библиотек является то, что всю смесь можно скрининговать в одном процессе. Это делает эти библиотеки очень полезными в фармацевтических исследованиях.
Частичные библиотеки полных комбинаторных библиотек также могут быть синтезированы. Некоторые из них могут быть использованы в деконволюции
Деконволюция библиотек, отколотых от твердой подложки
Если синтезированные молекулы комбинаторной библиотеки отщепляются от твердой подложки, образуется растворимая смесь. В таком растворе могут быть найдены миллионы различных соединений. Когда был разработан этот синтетический метод, сначала казалось невозможным идентифицировать молекулы и найти молекулы с полезными свойствами. Однако были разработаны стратегии идентификации полезных компонентов для решения этой проблемы. Все эти стратегии основаны на синтезе и тестировании частичных библиотек. Ранняя итеративная стратегия была разработана Фуркой в 1982 году. Позднее этот метод был независимо опубликован Эрбом и др. под названием «Рекурсивная деконволюция»
Рекурсивная деконволюция
Метод понятен по рисунку. Библиотека пептидов из 27 членов синтезируется из трех аминокислот. После первого (A) и второго (B) циклов образцы откладываются перед смешиванием. Продукты третьего цикла (C) расщепляются перед смешиванием, затем проверяются на активность. Предположим, что группа, помеченная знаком +, активна. Все члены имеют красную аминокислоту в последней позиции связывания (CP). Следовательно, активный член также имеет красную аминокислоту в последней CP. Затем красная аминокислота соединяется с тремя образцами, отложенными после второго цикла (B), чтобы получить образцы D. После расщепления образуются три образца E. Если после тестирования образец, помеченный знаком +, является активным, это показывает, что синяя аминокислота занимает вторую CP в активном компоненте. Затем к трем образцам A сначала присоединяется синяя, а затем красная аминокислота (F), затем снова проверяется после расщепления (G). Если компонент + оказывается активным, последовательность активного компонента определяется и отображается в H.
Позиционное сканирование
Позиционное сканирование было введено независимо Фуркой и др. и Пиниллой и др. Метод основан на синтезе и тестировании серий подбиблиотек, в которых определенная позиция последовательности занята одной и той же аминокислотой. На рисунке показаны девять подбиблиотек (B1-D3) полной библиотеки тримеров пептидов (A), созданной из трех аминокислот. В подбиблиотеках есть позиция, которая занята одной и той же аминокислотой во всех компонентах. При синтезе подбиблиотеки носитель не делится, и только одна аминокислота связана со всем образцом. В результате одна позиция действительно занята одной и той же аминокислотой во всех компонентах. Например, в подбиблиотеке B2 позиция 2 занята «желтой» аминокислотой во всех девяти компонентах. Если в скрининговом тесте эта подбиблиотека дает положительный ответ, это означает, что позиция 2 в активном пептиде также занята «желтой» аминокислотой. Аминокислотную последовательность можно определить, протестировав все девять (или иногда меньше) подбиблиотек.
Библиотеки пропусков
В библиотеках пропусков отсутствует определенная аминокислота во всех пептидах смеси. На рисунке показана полная библиотека и три библиотеки пропусков. Вверху показаны пропущенные аминокислоты. Если библиотека пропусков дает отрицательный результат теста, пропущенная аминокислота присутствует в активном компоненте.
Деконволюция связанных комбинаторных библиотек
Если пептиды не отщепляются от твердой подложки, мы имеем дело со смесью шариков, каждый из которых содержит один пептид. Смит и его коллеги ранее показали, что пептиды можно тестировать и в связанной форме. Этот подход также использовался при скрининге пептидных библиотек. Связанная пептидная библиотека тестировалась с растворенным целевым белком. Выбирались шарики, к которым был прикреплен белок, удалялся белок из шарика, затем связанный пептид идентифицировался секвенированием. Тейлор и Моркен использовали несколько иной подход. Они использовали инфракрасную термографию для идентификации катализаторов в библиотеках, не связанных с пептидами. Метод основан на тепле, которое выделяется в шариках, содержащих катализатор, когда связанная библиотека погружается в раствор субстрата. Когда шарики исследуются через инфракрасный микроскоп, шарики, содержащие катализатор, выглядят как яркие пятна и их можно выделить.
Закодированные комбинаторные библиотеки
Если мы имеем дело с библиотекой непептидных органических библиотек, то не так просто определить идентичность содержимого бусины, как в случае пептидной. Чтобы обойти эту трудность, были разработаны методы присоединения к бусинам, параллельно с синтезом библиотеки, молекул, которые кодируют структуру соединения, образованного в бусине.
Ольмейер и его коллеги опубликовали метод бинарного кодирования. Они использовали смеси из 18 молекул-меток, которые после отщепления от бусинок могли быть идентифицированы с помощью газовой хроматографии с захватом электронов. Саркар и др. описали хиральные олигомеры пентеновых амидов (COPA), которые можно использовать для построения библиотек OBOC с массовым кодированием.
Керр и др. представили инновационный метод кодирования. К бусинам был прикреплен ортогонально защищенный съемный бифункциональный линкер. Один конец линкера использовался для присоединения неприродных строительных блоков библиотеки, в то время как к другому концу были присоединены кодирующие аминокислотные триплеты. Строительными блоками были неприродные аминокислоты, и ряд их кодирующих аминокислотных триплетов мог быть определен деградацией Эдмана. Важным аспектом этого вида кодирования была возможность отщеплять от бусин элементы библиотеки вместе с прикрепленными к ним кодирующими метками, образуя растворимую библиотеку. Тот же подход использовался Николаевым и др. для кодирования пептидами.
В 1992 году Бреннер и Лернер представили последовательности ДНК для кодирования бусин твердой подложки, что оказалось наиболее успешным методом кодирования. Нильсен, Бреннер и Янда также использовали подход Керра для реализации кодирования ДНК
В последнее время произошли важные достижения в секвенировании ДНК. Методы следующего поколения позволяют секвенировать большое количество образцов параллельно, что очень важно при скрининге библиотек, кодируемых ДНК. Было еще одно нововведение, которое способствовало успеху кодирования ДНК. В 2000 году Хэлпин и Харбери исключили твердую подложку из синтеза сплит-микс ДНК-кодируемых комбинаторных библиотек и заменили ее кодирующими ДНК-олигомерами. В твердофазном синтезе сплит-пула количество компонентов библиотек не может превышать количество шариков подложки. Благодаря новому подходу авторов это ограничение было устранено и стало возможным готовить новые соединения практически в неограниченном количестве. Например, датская компания Nuevolution синтезировала ДНК-кодируемую библиотеку, содержащую 40 триллионов! компонентов
ДНК-кодируемые библиотеки растворимы, что позволяет применять эффективное аффинное связывание при скрининге. Некоторые авторы применяют DEL для акроминимов ДНК-кодируемых комбинаторных библиотек, другие используют DECL. Последнее кажется лучшим, поскольку в этом названии четко выражена комбинаторная природа этих библиотек.
Несколько типов ДНК-кодируемых комбинаторных библиотек были введены и описаны в первом десятилетии текущего тысячелетия. Эти библиотеки очень успешно применяются в исследовании лекарственных средств.
Подробности об их синтезе и применении можно найти на странице ДНК-кодируемой химической библиотеки.
У ДНК-кодируемых растворимых комбинаторных библиотек также есть недостатки. Прежде всего, преимущество, получаемое от использования твердой подложки, полностью теряется. Кроме того, полиионный характер ДНК-кодирующих цепей ограничивает полезность неводных растворителей в синтезе. По этой причине многие лаборатории выбирают разработку ДНК-совместимых реакций для использования в синтезе DECL. Довольно много из доступных уже описано
Материаловедение
Материаловедение применило методы комбинаторной химии для открытия новых материалов. Пионер этой работы был П.Г. Шульц и др. в середине девяностых годов в контексте люминесцентных материалов, полученных соосаждением элементов на кремниевую подложку. Его работе предшествовал Дж. Дж. Ханак в 1970 году, но в то время компьютерные и робототехнические инструменты не были доступны для распространения этого метода. Работу продолжили несколько академических групп, а также компании с крупными программами исследований и разработок (Symyx Technologies, GE, Dow Chemical и др.). Этот метод широко использовался в катализе, покрытиях, электронике и во многих других областях. Применение соответствующих информационных инструментов имеет решающее значение для обработки, администрирования и хранения огромных объемов создаваемых данных. Также были разработаны новые типы методов планирования экспериментов для эффективного решения больших экспериментальных пространств, которые можно охватить с помощью комбинаторных методов.
Библиотеки, ориентированные на разнообразие
Несмотря на то, что комбинаторная химия была неотъемлемой частью раннего открытия лекарств на протяжении более двух десятилетий, до сих пор только одно химическое вещество, синтезированное de novo комбинаторной химией, было одобрено FDA для клинического использования (сорафениб, ингибитор мультикиназы, показанный для лечения рака почки на поздних стадиях). Анализ низкого уровня успешности подхода был предложен для связи с довольно ограниченным химическим пространством, охватываемым продуктами комбинаторной химии. Сравнивая свойства соединений в библиотеках комбинаторной химии со свойствами одобренных лекарств и натуральных продуктов, Фехер и Шмидт отметили, что библиотеки комбинаторной химии особенно страдают от отсутствия хиральности, а также жесткости структуры, оба из которых широко рассматриваются как свойства, подобные свойствам лекарств. Несмотря на то, что открытие лекарств на основе натуральных продуктов, вероятно, не было самой модной тенденцией в фармацевтической промышленности в последнее время, большая часть новых химических объектов по-прежнему являются соединениями природного происхождения, и, таким образом, было высказано предположение, что эффективность комбинаторной химии может быть улучшена за счет повышения химического разнообразия библиотек скрининга. Поскольку хиральность и жесткость являются двумя наиболее важными характеристиками, отличающими одобренные лекарственные препараты и натуральные продукты от соединений в библиотеках комбинаторной химии, именно этим двум вопросам уделяется особое внимание в так называемых библиотеках, ориентированных на разнообразие, т. е. коллекциях соединений, целью которых является охват всего химического пространства, а не просто огромного количества соединений.
Подкласс патентной классификации
В 8-й редакции Международной патентной классификации (МПК), вступившей в силу 1 января 2006 года, для патентных заявок и патентов, связанных с изобретениями в области комбинаторной химии, создан специальный подкласс: «C40B».