Изотермическая микрокалориметрия

Изотермическая микрокалориметрия (IMC) — лабораторный метод мониторинга и динамического анализа химических, физических и биологических процессов в режиме реального времени. В течение часов или дней IMC определяет начало, скорость, степень и энергетику таких процессов для образцов в небольших ампулах (например, 3–20 мл) при постоянной заданной температуре (около 15–150 °C).

IMC выполняет этот динамический анализ путем измерения и записи в зависимости от затраченного времени чистой скорости теплового потока (мкДж/с = мкВт) к ампуле с образцом или от нее, а также совокупного количества тепла (Дж), потребленного или произведенного.

IMC является мощным и универсальным аналитическим инструментом по четырем тесно связанным причинам:

Таким образом, метод IMC изучения скорости процессов широко применим, обеспечивает непрерывные данные в реальном времени и является чувствительным. Измерение просто провести, оно происходит автоматически и не мешает (например, не требуются флуоресцентные или радиоактивные маркеры).

Однако есть два основных предостережения, которые следует учитывать при использовании IMC:

В общем, возможные применения IMC ограничены только воображением человека, который решит использовать его в качестве аналитического инструмента, и физическими ограничениями метода. Помимо двух общих ограничений (основных предостережений), описанных выше, эти ограничения включают размер образца и ампулы, а также температуры, при которых можно проводить измерения. IMC обычно лучше всего подходит для оценки процессов, которые происходят в течение нескольких часов или дней. IMC использовался в чрезвычайно широком спектре приложений, и многие примеры обсуждаются в этой статье, подкрепленные ссылками на опубликованную литературу. Обсуждаемые области применения варьируются от измерения медленной окислительной деградации полимеров и нестабильности опасных промышленных химикатов до обнаружения бактерий в моче и оценки воздействия лекарств на паразитических червей. В этой статье основное внимание уделяется приложениям последнего типа — биологии и медицины.

Обзор

Определение, цель и сфера применения

Калориметрия — это наука об измерении теплоты химических реакций или физических изменений. Калориметрия выполняется с помощью калориметра.

Изотермическая микрокалориметрия (ИМК) — это лабораторный метод непрерывного измерения в реальном времени скорости теплового потока (мкДж/с = мкВт) и совокупного количества тепла (Дж), потребляемого или производимого при практически постоянной температуре образцом, помещенным в прибор ИМК. Такое тепло возникает из-за химических или физических изменений, происходящих в образце. Тепловой поток пропорционален совокупной скорости изменений, происходящих в данный момент времени. Совокупное тепло, произведенное в течение данного интервала времени, пропорционально совокупному количеству совокупных изменений, которые имели место.

Таким образом, IMC является средством динамической, количественной оценки скорости и энергетики широкого спектра скоростных процессов, включая биологические процессы. Скорость процесса определяется здесь как физическое и/или химическое изменение, ход которого с течением времени может быть описан либо эмпирически, либо с помощью математической модели (Библиография: Glasstone, et al. 1941 и Johnson, et al. 1974 и уравнение скорости).

Простейшим применением IMC является обнаружение того, что в образце происходит один или несколько скоростных процессов, поскольку тепло выделяется или потребляется со скоростью, превышающей предел обнаружения используемого прибора. Это может быть полезно, например, в качестве общего индикатора того, что твердый или жидкий материал не инертен, а изменяется при заданной температуре. В биологических образцах, содержащих питательную среду, появление с течением времени заметного и возрастающего сигнала теплового потока является простым общим индикатором присутствия определенного типа реплицирующихся клеток.

Однако для большинства приложений крайне важно каким-либо образом знать, какой процесс или процессы измеряются путем мониторинга теплового потока. Как правило, это предполагает наличие детальных физических, химических и биологических знаний об объектах, помещенных в ампулу IMC, прежде чем ее помещать в прибор IMC, для оценки теплового потока с течением времени. В этом случае также необходимо проанализировать содержимое ампулы после проведения IMC-измерений теплового потока в течение одного или нескольких периодов времени. Кроме того, логические изменения содержимого ампулы могут использоваться для идентификации конкретного источника или источников теплового потока. Когда установлены зависимости скорости процесса и теплового потока, можно напрямую полагаться на данные IMC.

То, что IMC может измерить на практике, частично зависит от размеров образца, и они обязательно ограничены конструкцией прибора. Данный коммерческий прибор обычно принимает образцы фиксированного диаметра и высоты. Приборы, воспринимающие образцы размером до ок. 1 или 2 см в диаметре x ок. Типичная высота 5 см. В данном приборе более крупные образцы данного типа обычно производят более сильные сигналы теплового потока, и это может повысить точность обнаружения и точность.

Часто образцы представляют собой простые цилиндрические ампулы объемом от 3 до 20 мл (рис. 1), содержащие материалы, скоростные процессы которых представляют интерес, например: твердые вещества, жидкости, культивируемые клетки или любая комбинация этих или других предметов, которая, как ожидается, приведет к производству или потреблению тепла. Многие полезные измерения IMC можно провести с использованием простых запечатанных ампул, а стеклянные ампулы являются обычным явлением, поскольку стекло не подвержено химическим или физическим изменениям, вызывающим тепло. Однако иногда используют металлические или полимерные ампулы. Кроме того, доступны системы инструментов/ампул, которые позволяют впрыскивать или контролировать поток газов или жидкостей и/или обеспечивают механическое перемешивание образца.

Коммерческие приборы IMC позволяют измерять тепловой поток при температурах от ок. 15 °С – 150 °С. Диапазон для данного инструмента может быть несколько иным.

IMC чрезвычайно чувствителен – например. Тепло медленных химических реакций в образцах весом в несколько граммов, протекающих при скорости расхода реагентов в несколько процентов в год, можно обнаружить и количественно оценить за считанные дни. Примеры включают постепенное окисление полимерных материалов имплантатов и исследования срока годности твердых фармацевтических лекарственных форм (Применение: Твердые материалы).

Также скорость метаболического производства тепла, например. можно измерить несколько тысяч живых клеток, микроорганизмов или простейших в культуре в ампуле IMC. Количество такого метаболического тепла можно коррелировать (посредством экспериментов) с количеством присутствующих клеток или организмов. Таким образом, данные IMC можно использовать для мониторинга в реальном времени количества присутствующих клеток или организмов, а также чистой скорости роста или снижения этого количества (Приложения: биология и медицина).

Хотя обсуждаются некоторые небиологические применения IMC (Применение: Твердые материалы), в данной статье основное внимание уделяется использованию IMC в биологических процессах (Применение: Биология и медицина).

Полученные данные

Графическое отображение данных IMC общего типа показано на рис. 2. Вверху приведен график зарегистрированного теплового потока (мкДж/с = мкВт) в зависимости от времени от образца в запечатанной ампуле из-за экзотермической скорости. процесс, который начинается, ускоряется, достигает максимального теплового потока, а затем затухает. Такие данные непосредственно полезны (например, обнаружение процесса и его продолжительности при фиксированных условиях), но данные также легко оценить математически для определения параметров процесса. Например, на рис. 2 также показано объединение данных о тепловом потоке, где показано накопленное тепло (Дж) в зависимости от времени. Как показано, такие параметры, как максимальная скорость роста (выделения тепла) процесса и продолжительность лаг-фазы, прежде чем процесс достигнет максимального тепла, могут быть рассчитаны на основе интегрированных данных. Расчеты с использованием данных о расходе тепла, хранящихся в компьютерных файлах, легко автоматизировать. Анализ данных IMC таким образом для определения параметров роста имеет важные применения в науках о жизни (приложения: биология и медицина). Кроме того, скорости теплового потока, полученные при ряде температур, можно использовать для определения энергии активации оцениваемого процесса (Hardison et al. 2003).

История развития

Лавуазье и Лапласу приписывают создание и использование первого изотермического калориметра ок. 1780 г. (библиография: Лавуазье А. и Лаплас PS 1780). В их приборе использовался лед для создания относительно постоянной температуры в замкнутом пространстве. Они поняли, что когда они помещали на лед образец, выделяющий тепло (например, живое животное), масса жидкой воды, выделяемой тающим льдом, была прямо пропорциональна теплу, выделяемому образцом.

Многие современные конструкции инструментов IMC основаны на работах, выполненных в Швеции в конце 1960-х и начале 1970-х годов (Wadsö 1968, Suurkuusk & Wadsö 1974). В этой работе использовались преимущества параллельной разработки полупроводниковых электронных устройств — в частности, коммерческой доступности небольших устройств с термоэлектрическим эффектом (Пельтье-Зебека) для преобразования теплового потока в напряжение — и наоборот.

В 1980-х годах появились многоканальные конструкции (Suurkuusk 1982), которые позволяют проводить параллельную оценку нескольких образцов. Это значительно увеличило мощность и полезность IMC и привело к усилиям по тонкой настройке метода (Thorén et al. 1989). Большая часть дальнейшего проектирования и разработки, выполненной в 1990-х годах, также была выполнена в Швеции Вадсё и Сууркууском и их коллегами. Эта работа использовала преимущества параллельного развития технологии персональных компьютеров, что значительно увеличило возможность легкого хранения, обработки и интерпретации данных о тепловом потоке в зависимости от времени.

Работа по разработке приборов, начавшаяся с 1990-х годов, позволила еще больше воспользоваться преимуществами продолжающегося развития твердотельной электроники и технологий персональных компьютеров. Это позволило создать инструменты IMC с повышенной чувствительностью и стабильностью, количеством параллельных каналов и еще большей способностью удобно записывать, хранить и быстро обрабатывать данные IMC. В связи с более широким использованием значительное внимание было уделено созданию стандартов для описания характеристик инструментов IMC (например, точности, достоверности, чувствительности) и методов калибровки (Wadsö and Goldberg 2001).

Приборы и принципы измерения

Конфигурации приборов

Современные инструменты IMC на самом деле являются полуадиабатическими, т.е. Теплопередача между образцом и окружающей средой не равна нулю (адиабатическая), поскольку измерение теплового потока IMC зависит от существования небольшого перепада температур — ок. 0,001 °С. Однако, поскольку разница настолько мала, измерения IMC по существу являются изотермическими. На рис. 3 показан обзор прибора IMC, который содержит 48 отдельных модулей измерения теплового потока. Показан один модуль. Измерительным блоком модуля обычно является прибор Пельтье-Зеебека. Устройство вырабатывает напряжение, пропорциональное разнице температур между образцом, выделяющим или потребляющим тепло, и термически неактивным эталоном, имеющим температуру радиатора. Разница температур, в свою очередь, пропорциональна скорости, с которой образец производит или потребляет тепло (см. «Калибровка» ниже). Все модули в приборе используют один и тот же радиатор и термостат и, таким образом, все выдают данные при одной и той же заданной температуре. Однако, как правило, можно запускать и останавливать измерения в каждой ампуле независимо. В высокопараллельном (например, 48-канальном) приборе, таком как показанный на рис. 3, это позволяет выполнять (запускать и останавливать) несколько различных экспериментов, когда это удобно.

Альтернативно, приборы IMC могут быть оснащены дуплексными модулями, которые выдают сигналы, пропорциональные разнице теплового потока между двумя ампулами. Одна из двух таких дуплексных ампул часто является бланком или контролем, т.е. образец, который не содержит материала, вызывающего интересующий процесс скорости, но содержимое которого в остальном идентично тому, что находится в ампуле с образцом. Это дает возможность исключить незначительные реакции с выделением тепла, которые не представляют интереса, например, постепенные химические изменения в течение нескольких дней в среде для культивирования клеток при температуре измерения. Многие полезные измерения IMC можно провести с использованием простых запаянных ампул. Однако, как упоминалось выше, доступны системы инструментов/ампул, которые позволяют или даже контролируют поток газов или жидкостей к образцам и/или от них и/или обеспечивают механическое перемешивание образцов.

Справочные вставки

Тепловой поток обычно измеряется относительно эталонной вставки, как показано на рис. 3. Обычно это металлический образец, который химически и физически стабилен при любой температуре в рабочем диапазоне прибора и, следовательно, сам не производит и не потребляет тепло. Для достижения наилучших результатов эталон должен иметь теплоемкость, близкую к теплоемкости образца (например, ампула IMC с содержимым).

Режимы работы

Режим теплопроводности (hc)

Коммерческие приборы IMC часто работают как калориметры теплопроводности (hc), в которых тепло, выделяемое образцом (т.е. материалом в ампуле), течет к радиатору, обычно алюминиевому блоку, находящемуся в термостате (например, ванне с постоянной температурой). Как упоминалось выше, прибор IMC, работающий в режиме hc, не является точно изотермическим, поскольку обязательно существуют небольшие различия между заданной температурой и температурой образца, поэтому существует измеримый тепловой поток. Однако небольшие изменения температуры образца не оказывают существенного влияния на температуру радиатора, поскольку теплоемкость радиатора намного выше, чем теплоемкость образца — обычно около 100 мкм. 100×.

Передача тепла между образцом и радиатором происходит через устройство Пельтье-Зебека, позволяющее динамически измерять выделяемое или потребляемое тепло. В приборах исследовательского качества температура термостата/радиатора обычно имеет точность < ±0,1 К и поддерживается в пределах ок. < ±100 мкК/24 часа. Точность, с которой поддерживается температура радиатора с течением времени, является основным фактором, определяющим точность измерений теплового потока с течением времени. Преимуществом режима hc является большой динамический диапазон. Тепловые потоки ок. Мощность 50 000 мкВт можно измерить с точностью около 1 000 мкВт. ±0,2 мкВт. Таким образом, измеряя тепловой поток ок. >0,2 мкВт выше базового уровня представляет собой обнаружение теплового потока, хотя часто используется более консервативное обнаружение, в 10 раз превышающее предел точности [необходимы пояснения].

Режим компенсации мощности (ПК)

Некоторые приборы IMC работают (или могут также работать) как калориметры с компенсацией мощности (ПК). В этом случае для поддержания образца при заданной температуре выделяемое тепло компенсируется с помощью устройства Пельтье-Зебека. Потребляемое тепло компенсируется либо электрическим нагревателем, либо изменением полярности устройства (ван Херваарден, 2000). Если данный прибор работает в режиме pc, а не в режиме hc, точность измерения теплового потока остается той же (например, около ±0,2 мкВт). Преимуществом режима компенсации является меньшая постоянная времени – т.е. время, необходимое для обнаружения данного импульса теплового потока, примерно в 10 раз короче, чем в режиме проводимости. Недостатком является ок. Динамический диапазон в 10 раз меньше по сравнению с режимом hc.

Калибровка

При работе в режиме hc или pc плановая калибровка коммерческих приборов обычно выполняется с помощью встроенных электрических нагревателей. Рабочие характеристики электронагревателей, в свою очередь, можно проверить с использованием образцов с известной теплоемкостью или образцов, которые производят химические реакции, тепловыделение которых на единицу массы известно из термодинамики (Wadsö and Goldberg 2001). В режиме hc или pc результирующий сигнал представляет собой записываемое компьютером напряжение, откалиброванное для представления теплового потока образца в диапазоне мкВт в зависимости от времени. В частности, если в образце не существует значительных температурных градиентов, то P = e_C [U + t (dU/dt)], где P — тепловой поток (т. е. мкВт), ε_C — калибровочная константа, U — измеренная разность потенциалов на термобатарее, а t — постоянная времени. В установившихся условиях, например, при высвобождении постоянного электрического калибровочного тока, это упрощается до P = e_C U. (Wadsö and Goldberg 2001).

Ампулы

Многие весьма полезные измерения IMC можно проводить в запечатанных ампулах (рис. 1), которые обеспечивают преимущества простоты, защиты от загрязнения и (при необходимости) существенного запаса биологической безопасности для лиц, обращающихся с ампулами или подвергающихся их воздействию. Закрытая ампула может содержать любую желаемую комбинацию твердых веществ, жидкостей, газов или предметов биологического происхождения. Исходный состав газа в головном пространстве ампулы можно контролировать путем герметизации ампулы в желаемой газовой среде.

Однако существуют также конструкции приборов/ампул IMC, которые позволяют контролировать поток газа или жидкости через ампулу во время измерения и/или механического перемешивания. Кроме того, при наличии соответствующих принадлежностей некоторые приборы IMC могут работать как приборы ITC (изотермическая титрационная калориметрия). Тема ITC рассматривается в другом месте (см. Изотермическая титрационная калориметрия). Кроме того, некоторые приборы IMC могут регистрировать тепловой поток, пока температура медленно изменяется (сканируется) с течением времени. Скорость сканирования должна быть медленной (примерно ± 2 °C/ч), чтобы поддерживать образцы IMC (например, несколько граммов) достаточно близко к температуре радиатора (<примерно 0,1 °C). Быстрое сканирование температуры является прерогативой приборов дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), которые обычно используют гораздо меньшие образцы. Некоторые приборы ДСК могут работать в режиме IMC, но небольшой размер ампулы (и, следовательно, образца), необходимый для сканирования, ограничивает полезность и чувствительность приборов ДСК, используемых в режиме IMC.

Основная методология

Установка температуры

Измерения скорости теплового потока (мкДж/с = мкВт) выполняются путем установки термостата прибора IMC на выбранную температуру и стабилизации радиатора прибора при этой температуре. Если прибор IMC, работающий при одной температуре, устанавливается на новую температуру, повторная стабилизация при новой настройке температуры может занять несколько часов — даже день. Как объяснялось выше, достижение и поддержание точно стабильной температуры имеет основополагающее значение для достижения точных измерений теплового потока в диапазоне мкВт в течение длительного времени (например, дней).

Представляем образец

После стабилизации температуры, если используется подготовленная снаружи ампула (или какой-либо твердый образец размеров ампулы), ее медленно вводят (например, опускают) в измерительный модуль прибора, обычно поэтапно. Цель состоит в том, чтобы гарантировать, что к моменту нахождения ампулы/образца в положении измерения ее температура будет близка (в пределах примерно 0,001 °С) к температуре измерения. Это делается для того, чтобы любой измеряемый затем тепловой поток был обусловлен процессами скорости образца, а не непрерывным процессом доведения образца до заданной температуры. Время введения образца в ампуле IMC объемом 3–20 мл в положение измерения составляет ок. 40 минут на многих инструментах. Это означает, что тепловой поток от любых процессов, происходящих внутри образца в течение периода введения, не будет зарегистрирован.

Если используется ампула на месте и вводится какой-либо агент или образец, это также создает период нестабильности, но он составляет порядка 1 минуты. На рис. 5 приведены примеры как длительного периода, необходимого для стабилизации инструмента, если ампула вводится напрямую, так и короткого периода нестабильности из-за инъекции.

Запись данных

После процесса введения тепловой поток образца может быть точно записан непрерывно, так долго, как это представляет интерес. Чрезвычайная стабильность инструментов исследовательского класса (< ±100 мкК/24 ч) означает, что точные измерения могут быть (и часто делаются) сделаны в течение периода в несколько дней. Поскольку сигнал теплового потока по существу считывается в реальном времени, он служит средством для принятия решения о том, происходит ли еще интересующий тепловой поток. Кроме того, современные приборы хранят данные о тепловом потоке в зависимости от времени в виде компьютерных файлов, поэтому возможны как реальное, так и ретроспективное графическое отображение и математический анализ данных.

Удобство использования

Как указано ниже, IMC имеет много преимуществ как метод анализа тарифных процессов, но есть и некоторые оговорки, которые следует учитывать.

Преимущества

Широко применимо

Можно изучить любой процесс скорости, если подходящие образцы соответствуют геометрии инструментального модуля IMC, и продолжить со скоростями, подпадающими под методологию IMC (см. выше). Как показано в разделе «Приложения», IMC используется для количественной оценки чрезвычайно широкого диапазона скоростных процессов in vitro, например. от стабильности полимеров в твердом состоянии (Hardison et al. 2003) до эффективности лекарственных соединений против паразитических червей (Maneck et al. 2011). IMC также может определять совокупную частоту нехарактерных, сложных или множественных взаимодействий (Льюис и Дэниелс). Это особенно полезно для сравнительного скрининга, т.е. влияние различных комбинаций состава материала и/или процессов изготовления на общую физико-химическую стабильность.

В режиме реального времени и непрерывно

Данные о тепловом потоке IMC получаются как колебания напряжения в зависимости от времени, сохраняются в виде компьютерных файлов и могут отображаться практически в реальном времени — по мере того, как происходит процесс скорости. Напряжение, связанное с тепловым потоком, является постоянным во времени, но в современных приборах оно обычно снимается в цифровом виде. Частотой цифровой выборки можно управлять по мере необходимости, т.е. частая выборка быстрых изменений теплового потока для лучшего временного разрешения или более медленная выборка медленных изменений, чтобы ограничить размер файла данных.

Чувствительный и быстрый

IMC достаточно чувствителен для обнаружения и количественной оценки за короткое время (часы, дни) реакций, которые потребляют лишь несколько процентов реагентов в течение длительного времени (месяцы). Таким образом, IMC позволяет избежать длительного ожидания, часто необходимого для накопления достаточного количества продукта реакции для обычных (например, химических) анализов. Это относится как к физическим, так и к биологическим образцам (см. Приложения).

Прямой

При каждой комбинации переменных образца и заданной температуры, представляющей интерес, IMC обеспечивает прямое определение кинетики теплового потока и совокупной теплоты скоростных процессов. Это позволяет избежать необходимости предполагать, что процесс скорости остается неизменным, когда температура или другие контролируемые переменные изменяются перед измерением IMC.

Простой

Для сравнения влияния экспериментальных переменных (например, начальных концентраций) на скорость процессов IMC не требует разработки и использования химических или других методов анализа. Если требуются абсолютные данные (например, количество продукта, произведенного в ходе процесса), анализы можно проводить параллельно с образцами, идентичными тем, которые использовались для ИМК (и/или с образцами ИМК после проведения ИМК). Полученные данные анализа используются для калибровки данных скорости, полученных IMC.

Невмешательство

IMC не требует добавления маркеров (например, флуоресцентных или радиоактивных веществ) для регистрации процессов скорости. Можно использовать неповрежденные образцы, и после проведения IMC образец не изменяется (за исключением происшедших процессов). Образец после IMC может быть подвергнут любому виду физической, химической, морфологической или другой интересующей оценки.

Предостережения

Пропущенные данные

Как указано в описании методологии, при использовании метода IMC введения запаянной ампулы невозможно уловить тепловой поток в течение первых ок. 40 минут, пока образец медленно доводится до заданной температуры. Таким образом, в этом режиме IMC лучше всего подходит для изучения процессов, которые медленно начинаются или медленно протекают при заданной температуре. Это предостережение также применимо ко времени до вставки, т.е. время, прошедшее между подготовкой образца (когда затем может начаться процесс определения скорости) и началом процесса введения IMC (Charlebois et al. 2003). Этот последний эффект обычно сводится к минимуму, если температура, выбранная для IMC, значительно выше (например, 37 °C), чем температура, при которой готовится образец (например, 25 °C).

Посторонние данные

IMC фиксирует совокупное производство или потребление тепла в результате всех процессов, происходящих внутри образца, включая, например,

Таким образом, необходимо проявлять большую осторожность при экспериментальном планировании и проектировании, чтобы определить все возможные процессы, которые могут иметь место. Часто необходимо проектировать и проводить предварительные исследования, направленные на систематическое определение того, происходят ли множественные процессы, и если да, то их вклад в совокупный тепловой поток. Одна из стратегий, чтобы исключить посторонние данные о тепловом потоке, заключается в сравнении теплового потока для образца, в котором происходит интересующий процесс скорости, с тепловым потоком от пустого образца, который включает все в интересующем образце, за исключением элемента, который будет подвергаться интересующему процессу скорости. Это можно напрямую выполнить с помощью приборов, имеющих дуплексные модули IMC, которые сообщают чистую разницу теплового потока между двумя ампулами.

Приложения

После обсуждения некоторых специальных источников информации о применении IMC рассматриваются несколько конкретных категорий IMC-анализа скоростных процессов, а также недавние примеры (со ссылками на литературу) обсуждаются в каждой категории.

Специальные источники информации о применении IMC

Справочники

В библиографии перечислены четыре обширных тома Handbook of Thermal Analysis and Calorimetry: Vol. 1 Principles and Practice (1998), Vol. 2 Applications to Inorganic and Miscellaneous Materials (2003), Vol. 3 Applications to Polymers and Plastics (2002) и Vol. 4 From Macromolecules to Man (1999). Они представляют собой основной источник информации (и ссылок на литературу) по приложениям и примерам ИМК, опубликованным до 2000 года.

Замечания по применению

Некоторые производители приборов IMC собрали рекомендации по применению и сделали их доступными для общественности. Примечания часто (но не всегда) представляют собой адаптацию журнальных статей. Примером может служить Сборник микрокалориметрии Vol. I и II, предложенные TA Instruments, Inc. и перечисленные в библиографии.

«Белки» первый раздел примечаний в т. I не представляет здесь интереса, так как описывает исследования, использующие изотермическую титровальную калориметрию. Последующие разделы Vol. I, Life & Biological Sciences и Pharmaceuticals содержат рекомендации по применению как IMC, так и дифференциальной сканирующей калориметрии. Том. II сборника почти полностью посвящен приложениям IMC. Его разделы озаглавлены «Цемент», «Энергетика», «Материалы» и «Другое». Возможным недостатком этих двух конкретных сборников является то, что ни одна из примечаний не датирована. Хотя сборники были опубликованы в 2009 году, в некоторых примечаниях описываются инструменты IMC, которые использовались много лет назад и больше не доступны. Таким образом, некоторые из заметок, хотя и актуальны и поучительны, часто описывают исследования, проведенные до 2000 года.

Примеры приложений

В общем, возможные применения IMC ограничены только воображением человека, который решит использовать IMC в качестве аналитического инструмента — в рамках ранее описанных ограничений, представленных существующими инструментами и методологией IMC. Это связано с тем, что это универсальное средство контроля скорости любого химического, физического или биологического процесса. Ниже приведены некоторые категории приложений IMC с примерами в каждой. В большинстве категорий опубликованных примеров гораздо больше, чем упомянутых и на которые ссылаются. Категории несколько произвольны и часто пересекаются. Другой набор категорий может быть столь же логичным, и можно добавить больше категорий.

Твердые материалы

Формирование

ИМК широко используется для изучения скорости образования различных материалов различными процессами. Лучше всего он подходит для изучения процессов, которые происходят медленно, т.е. в течение нескольких часов или дней. Ярким примером является изучение реакций гидратации и схватывания составов кальциево-минеральных цементов. В одной статье представлен обзор (Gawlicki и др., 2010), а в другой описан простой подход (Evju, 2003). Другие исследования сосредоточены на понимании гидратации цемента, полученном с помощью IMC в сочетании с ИК-спектроскопией (Ylmen et al., 2010), а также на использовании IMC для изучения влияния переменных состава на гидратацию цемента и время схватывания (Xu et al., 2011).

IMC также можно удобно использовать для изучения скорости и количества гидратации (в воздухе с известной влажностью) кальциевых минералов или других минералов. Чтобы обеспечить воздух с известной влажностью для таких исследований, небольшие контейнеры с насыщенными солевыми растворами можно поместить в ампулу IMC вместе с негидратированным минеральным образцом. Затем ампулу запечатывают и вводят в прибор IMC. Насыщенный солевой раствор поддерживает воздух в ампуле при известной относительной влажности, а различные обычные солевые растворы обеспечивают влажность в диапазоне, например, от 32 до 100% относительной влажности. Такие исследования были проведены на частицах гидроксиапатита кальция размером в мкм и наночастицах биоактивного стекла, содержащего кальций (Doostmohammadi et al. 2011).

Стабильность

IMC хорошо подходит для быстрой количественной оценки скоростей медленных изменений в материалах (Willson et al. 1995). Такие оценки по-разному описываются как исследования стабильности, деградации или срока годности.

Например, IMC уже много лет широко используется при изучении срока годности твердых лекарственных форм в фармацевтической промышленности (Pikal et al. 1989, Hansen et al. 1990, Konigbauer et al. 1992). IMC обладает способностью обнаруживать медленные разложение во время искусственного хранения на полке происходит гораздо быстрее, чем при использовании традиционных аналитических методов, и без необходимости использования методов химического анализа. IMC также является быстрым и чувствительным методом определения часто функционально важного аморфного содержания таких лекарств, как нифедипин (Vivoda et al. 2011).

IMC можно использовать для быстрого определения скорости медленных изменений в промышленных полимерах. Например, известно, что стерилизация гамма-излучением материала, часто используемого для хирургических имплантатов — полиэтилена сверхвысокой молекулярной массы (UHMWPE), — приводит к образованию свободных радикалов в полимере. Результатом является медленное окисление и постепенное нежелательное охрупчивание полимера на полке или in vivo. IMC может обнаружить тепло, связанное с окислением, и количественно определить скорость окисления около 1% в год в облученном UHMWPE при комнатной температуре на воздухе (Charlebois et al. 2003). В связанном исследовании энергия активации была определена из измерений при ряде температур (Hardison et al. 2003).

IMC также очень полезен при оценке «потенциала выхода из-под контроля» материалов, которые представляют значительную опасность пожара или взрыва. Например, его использовали для определения автокаталитической кинетики гидропероксида кумола (ГПК), промежуточного продукта, который используется в химической промышленности и внезапное разложение которого привело к ряду пожаров и взрывов. На рис. 4 показаны данные IMC, подтверждающие термическое разложение ГПК при 5 различных температурах (Chen et al. 2008).

Биология и медицина

Термин «метаболика» можно использовать для описания исследований по количественному измерению скорости производства или потребления тепла в зависимости от времени клетками (включая микробы) в культуре, образцами тканей или небольшими целыми организмами. Как будет описано далее, метаболизм может быть полезен в качестве диагностического инструмента; особенно либо (а) при определении природы образца по его тепловому потоку в зависимости от временного размера при заданном наборе условий, либо (б) при определении эффектов, например, фармацевтические соединения на метаболические процессы, органический рост или жизнеспособность. Метаболизмика связана с метаболомикой. Последнее представляет собой систематическое изучение уникальных химических отпечатков пальцев, которые оставляют после себя определенные клеточные процессы; т.е. изучение профилей их низкомолекулярных метаболитов. Когда IMC используется для определения метаболизма, продукты изученных метаболических процессов впоследствии становятся доступными для метаболомических исследований. Поскольку в IMC не используются биохимические или радиоактивные маркеры, образцы после IMC состоят только из продуктов метаболизма и оставшейся культуральной среды (если таковая использовалась). Если метаболизмика и метаболомика используются вместе, они могут обеспечить полную запись метаболического процесса, происходящего in vitro: его скорости и энергетики, а также продуктов метаболизма.

Чтобы определить метаболизм с использованием IMC, конечно, изначально должно присутствовать достаточное количество клеток, тканей или организмов (или присутствовать позже, если во время измерений IMC происходит репликация), чтобы генерировать сигнал теплового потока, превышающий предел обнаружения данного прибора. Знаковая общая статья 2002 года по теме метаболизма дает прекрасную перспективу для рассмотрения исследований метаболизма IMC (см. Библиографию, West, Woodruff and Brown 2002). Он описывает, как связаны скорости метаболизма и как они масштабируются во всем диапазоне от «молекул и митохондрий до клеток и млекопитающих». Что важно для IMC, авторы также отмечают, что, хотя скорость метаболизма данного типа клеток млекопитающих in vivo заметно снижается с увеличением размера (массы) животного, размер животного-донора не влияет на скорость метаболизма клеток при культивировании. in vitro.

Биология клеток и тканей

Клетки млекопитающих в культуре имеют скорость метаболизма ок. 30×10-12 Вт/ячейка (рис. 2 и 3 в библиографии: West, Woodruff and Brown 2002). По определению, приборы IMC имеют чувствительность не менее 1×10-6 Вт (т.е. 1 мкВт). Следовательно, метаболическое тепло ок. Обнаружено 33 000 клеток. Основываясь на этой чувствительности, IMC использовался для выполнения большого количества новаторских исследований метаболизма культивируемых клеток млекопитающих в 1970-х и 1980-х годах в Швеции. Одна статья (Monti 1990) служит обширным руководством по работе, проделанной до 1990 года. Она включает пояснительный текст и 42 ссылки на исследования IMC теплового потока из культивируемых человеческих эритроцитов, тромбоцитов, лимфоцитов, клеток лимфомы, гранулоцитов, адипоцитов, скелетных мышц и т. д. и ткани миокарда. Исследования были проведены, чтобы определить, как и где IMC можно использовать в качестве метода клинической диагностики и/или дать представление о метаболических различиях между клетками здоровых людей и людей с различными заболеваниями или проблемами со здоровьем.

События с ок. 2000 год в IMC (например, массово-параллельные инструменты, компьютерное хранение и анализ данных о тепловом потоке в режиме реального времени) стимулировали дальнейшее использование IMC в биологии культивируемых клеток. Например, IMC был оценен для оценки антиген-индуцированной пролиферации лимфоцитов (Murigande et al. 2009) и выявил аспекты пролиферации, которые не наблюдались при использовании обычного метода прерывистого анализа радиоактивных маркеров. IMC также применяется в области тканевой инженерии. Одно исследование (Санторо и др., 2011) продемонстрировало, что IMC можно использовать для измерения скорости роста (т.е. пролиферации) в культуре хондроцитов человека, собранных для использования в тканевой инженерии. Оно показало, что IMC потенциально может служить для определения эффективности различных составов питательных сред, а также для определения того, можно ли выращивать клетки, пожертвованные данным человеком, достаточно эффективно, чтобы рассмотреть возможность их использования для производства инженерной ткани.

IMC также использовался для измерения метаболической реакции культивируемых макрофагов на остатки износа хирургических имплантатов. IMC показала, что реакция была сильнее на частицы полиэтилена размером в микрометр, чем на частицы сплава Co аналогичного размера (Charlebois et al. 2002). Соответствующий документ охватывает общую тему применения IMC в области синтетических твердых материалов, используемых в хирургии и медицине (Lewis and Daniels 2003).

По крайней мере, два исследования показали, что IMC может иметь существенное значение при опухолевой патологии. В одном исследовании (Bäckman 1990) измерялась скорость теплопродукции клеток Т-лимфомы, культивируемых в суспензии. Изменения температуры и pH вызывали значительные изменения, но не скорость перемешивания и концентрация клеток. Более прямое исследование возможного диагностического использования (Каллерхофф и др., 1996) дало многообещающие результаты. Для изученных образцов биопсии урогенитальной ткани результаты показали:

«it is possible to differentiate between normal and tumorous tissue samples by microcalorimetric measurement based on the distinctly higher metabolic activity of malignant tissue. Furthermore, microcalorimetry allows a differentiation and classification of tissue samples into their histological grading.»

«Можно дифференцировать образцы нормальной и опухолевой ткани с помощью микрокалориметрического измерения, основанного на явно более высокой метаболической активности злокачественной ткани. Кроме того, микрокалориметрия позволяет дифференцировать и классифицировать образцы тканей по их гистологической классификации».

Токсикология

По состоянию на 2012 год IMC не получил широкого распространения в токсикологии культивируемых клеток, хотя он периодически и успешно использовался с 1980-х годов. IMC полезен в токсикологии, когда желательно наблюдать метаболизм культивируемых клеток в реальном времени и количественно определять скорость снижения метаболизма в зависимости от концентрации возможно токсичного агента. Одним из самых ранних сообщений (Анкерст и др., 1986) об использовании ИМК в токсикологии было исследование антителозависимой клеточной токсичности (ADCC) против клеток меланомы человека различных комбинаций антисыворотки, моноклональных антител, а также лимфоцитов периферической крови в качестве эффекторных клеток. Кинетику метаболического теплового потока клеток меланомы в зависимости от времени в закрытых ампулах измеряли в течение 20 часов. Авторы пришли к выводу, что

«…microcalorimetry is a sensitive and particularly suitable method for the analysis of cytotoxicity kinetics.»

«…микрокалориметрия является чувствительным и особенно подходящим методом анализа кинетики цитотоксичности».

IMC также используется в экологической токсикологии. В одном из ранних исследований (Thorén 1992) токсичность в отношении монослоев альвеолярных макрофагов частиц MnO₂, TiO₂ и SiO₂ (кремнезем) была оценено. Результаты IMC соответствовали результатам, полученным с помощью окрашивания эфиром флуоресцеина и анализа микроскопических изображений, за исключением того, что IMC показал токсическое воздействие кварца, не различимое при анализе изображений. Это последнее наблюдение – в соответствии с известными альвеолярными эффектами – показало авторам, что IMC является более чувствительным методом.

Намного позже (Лю и др., 2007) было показано, что IMC предоставляет данные о динамическом метаболизме, которые позволяют оценить токсичность хромата калия в отношении фибробластов Cr(VI). На рис. 5 показаны исходные результаты определения метаболического теплового потока от культивируемых фибробластов до оценки воздействия Cr(VI). Авторы пришли к выводу, что

«Микрокалориметрия оказывается удобным и простым методом измерения метаболических процессов… в… живых клетках. В отличие от стандартных процедур биоанализа, этот метод позволяет непрерывно измерять метаболизм живых клеток. Таким образом, мы показали, что Cr( VI) нарушает метаболические пути фибробластов человека и особенно утилизацию глюкозы».

Простая IMC в закрытой ампуле также использовалась и пропагандировалась для оценки токсичности культивируемых клеток материалов-кандидатов на хирургические имплантаты и, таким образом, служила методом скрининга биосовместимости. В одном исследовании (Xie et al., 2000) клетки почечных канальцев свиньи в культуре подвергались воздействию как полимеров, так и металлического титана в форме «микропланшет» с известной площадью поверхности в несколько см2. Авторы пришли к выводу, что IMC

«…это быстрый метод, удобный в использовании и с хорошей воспроизводимостью. Настоящий метод может в большинстве случаев заменить более трудоемкие световые и электронные микроскопические исследования для количественного определения прилипших клеток».

В другом исследовании материалов имплантата (Doostmohammadi et al. 2011) как быстрорастущая культура дрожжей, так и культура хондроцитов человека подвергались воздействию частиц (диаметром <50 мкм) гидроксиапатита кальция (ГК) и биоактивного (содержащего кальций) кварцевого стекла. Частицы стекла замедляли или ограничивали рост дрожжей в зависимости от увеличения концентрации частиц. Частицы ГК имели гораздо меньший эффект и никогда полностью не подавляли рост дрожжей в тех же концентрациях. Влияние обоих типов частиц на рост хондроцитов было минимальным при используемой концентрации. Авторы пришли к выводу, что

«Цитотоксичность дисперсных материалов, таких как биоактивное стекло и частицы гидроксиапатита, можно оценить с помощью метода микрокалориметрии. Это современный метод исследования биосовместимости и цитотоксичности биоматериалов in vitro, который можно использовать наряду со старыми традиционными анализами».

Микробиология

Публикации, описывающие использование IMC в микробиологии, начались в 1980-х годах (Jesperson 1982). Хотя некоторые микробиологические исследования IMC были направлены на вирусы (Heng et al., 2005) и грибы (Antoci et al., 1997), большинство из них касалось бактерий. В недавней статье (Braissant et al. 2010) представлено общее введение в метаболические методы IMC в микробиологии и обзор их применения в медицинской и экологической микробиологии. В статье также объясняется, как данные о тепловом потоке в зависимости от времени для бактерий в культуре являются точным выражением — как они происходят с течением времени — колебаний метаболической активности микроорганизмов и скорости репликации в данной среде (рис. 6).

В целом бактерии составляют примерно 1/10 размера клеток млекопитающих и производят примерно 1/10 меньше метаболического тепла, т.е. ок. 3×10−12 Вт/ячейка. Таким образом, по сравнению с клетками млекопитающих (см. выше) ок. В 10 раз больше бактерий — ок. 330 000 — должно присутствовать для создания обнаруживаемого теплового потока, т.е. 1 мкВт. Однако многие бактерии размножаются в культуре на несколько порядков быстрее, чем клетки млекопитающих, часто удваивая свою численность за считанные минуты (см. «Рост бактерий»). В результате небольшое первоначальное количество бактерий в культуре, первоначально не обнаруживаемое с помощью IMC, быстро образует обнаруживаемое количество. Например, 100 бактерий, удваивающихся каждые 20 минут, менее чем за 4 часа произведут >330 000 бактерий и, таким образом, создадут тепловой поток, обнаруживаемый с помощью IMC. Следовательно, IMC можно использовать для простого и быстрого обнаружения бактерий в медицинской сфере. Примеры включают обнаружение бактерий в продуктах тромбоцитов человеческой крови (Trampuz et al. 2007) и моче (Bonkat et al. 2011) и быстрое выявление туберкулеза (Braissant et al. 2010, Rodriguez et al. 2011). На рис. 7 показан пример времени обнаружения туберкулезных бактерий в зависимости от исходного количества бактерий, присутствующих в закрытой ампуле IMC, содержащей культуральную среду.

Для микробов в питательной среде в закрытых ампулах данные теплового потока IMC также можно использовать для точной оценки основных параметров роста микробов; то есть максимальный темп роста и продолжительность лаг-фазы до достижения максимального темпа роста. Это важное специальное применение базового анализа этих параметров, описанное ранее (Обзор: Полученные данные).

К сожалению, в литературе IMC есть несколько опубликованных статей, в которых связь между данными о тепловом потоке и ростом микробов в закрытых ампулах была неправильно понята. Однако в 2013 году было опубликовано обширное разъяснение, описывающее (а) детали связи между данными о тепловом потоке IMC и ростом микробов, (б) выбор математических моделей, описывающих рост микробов, и (в) определение параметров роста микробов на основе данных IMC. используя эти модели (Braissant et al. 2013).

Фармакодинамика

В качестве логического расширения возможностей IMC обнаруживать и количественно оценивать рост бактерий можно добавлять известные концентрации антибиотиков к бактериальной культуре, а затем использовать IMC для количественной оценки их воздействия на жизнеспособность и рост. IMC в закрытой ампуле позволяет легко собирать основную фармакологическую информацию, например: минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибиотика, необходимая для остановки роста данного организма. Кроме того, он может одновременно обеспечивать динамические параметры роста — время задержки и максимальную скорость роста (см. рис. 2, Howell et al. 2011, Braissant et al. 2013), которые оценивают механизмы действия. О бактерицидном действии (см. Бактерицид) свидетельствует увеличение времени задержки в зависимости от увеличения концентрации антибиотика, тогда как о бактериостатическом действии (см. Бактериостатическое средство) свидетельствует уменьшение скорости роста с увеличением концентрации. Подход IMC к оценке антибиотиков был продемонстрирован для ряда типов бактерий и антибиотиков (фон Ах и др., 2009). IMC в закрытой ампуле также позволяет быстро различать нормальные и резистентные штаммы бактерий, таких как Staphylococcus aureus (von Ah et al. 2008, Baldoni et al. 2009). IMC также использовался для оценки воздействия дезинфицирующих средств на жизнеспособность бактерий полости рта, прикрепившихся к материалам зубных имплантатов (Астасов-Фрауенхоффер и др., 2011). В аналогичном более раннем исследовании IMC использовался для измерения теплоты адгезии зубных бактерий к стеклу (Hauser-Gerspach et al. 2008).

Было продемонстрировано аналогичное успешное использование IMC для определения воздействия противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки в культуре в течение нескольких часов (Schön and Wadsö, 1988). Вместо подхода с закрытыми ампулами использовалась установка IMC, которая позволяла вводить лекарственное средство в перемешиваемые образцы.

По состоянию на 2013 год IMC использовался менее широко в фармакодинамических исследованиях in vitro на клетках млекопитающих, чем в микробных исследованиях.

Многоклеточные организмы

Можно использовать ИМК для проведения метаболических исследований живых многоклеточных организмов, если они достаточно малы, чтобы их можно было поместить в ампулы ИМК (Lamprecht & Becker 1988). Исследования ИМК проводились для изучения метаболизма куколок насекомых во время вентиляционных движений (Harak et al. 1996) и воздействия химических агентов на рост куколок (Kuusik et al. 1995). ИМК также оказался эффективным для оценки эффектов старения на метаболизм нематод (Braekman et al. 2002).

IMC также оказался очень полезным для оценки in vitro воздействия фармацевтических препаратов на тропических паразитических червей (Manneck et al. 2011-1, Maneck et al. 2011-2, Kirchhofer et al. 2011). Интересной особенностью этих исследований является использование простой ручной системы инъекции для введения фармацевтических препаратов в запечатанные ампулы, содержащие червей. Кроме того, IMC не только документирует общее снижение метаболизма с течением времени из-за приема лекарств, но также общую частоту двигательной активности червей и ее снижение амплитуды с течением времени, что отражается в колебаниях данных о тепловом потоке.

Экологическая биология

Благодаря своей универсальности IMC может быть эффективным инструментом в области биологии растений и окружающей среды. В раннем исследовании (Hansen et al. 1989) измерялась скорость метаболизма образцов тканей клонов лиственницы. Скорость прогнозировала долгосрочные темпы роста дерева, была постоянной для образцов с данного дерева и, как было обнаружено, коррелировала с известными вариациями долгосрочного роста клонов с разных деревьев.

Бактериальный оксалотрофный метаболизм распространен в окружающей среде, особенно в почвах. Оксалотрофные бактерии способны использовать оксалат в качестве единственного источника углерода и энергии. Закрытая ампула IMC использовалась для изучения метаболизма оксалотрофных почвенных бактерий, подвергавшихся воздействию как оптимизированной среды, содержащей оксалат калия в качестве единственного источника углерода, так и модельной почвы (Bravo et al. 2011). Используя оптимизированную среду, рост шести различных штаммов почвенных бактерий легко контролировался и воспроизводимо количественно определялся и дифференцировался в течение периода дней. Измерение IMC бактериального метаболического теплового потока в модельной почве было более сложным, но было продемонстрировано доказательство концепции.

Лунное молоко — белый кремовый материал, найденный в пещерах. Это незатвердевший мелкокристаллический осадок из известняка, состоящий в основном из карбонатов кальция и/или магния. В его образовании могут участвовать микробы. Трудно сделать вывод о микробной активности лунного молока на основе стандартных статических химических и микроскопических анализов состава и структуры лунного молока. Для решения этой проблемы использовалась закрытая ампула IMC (Braissant, Bindscheidler et al. 2011). Определить скорость роста хемогетеротрофных микробных сообществ на лунном молоке удалось после добавления различных источников углерода, имитирующих смеси, которые будут контактировать с лунным молоком в результате таяния снега или осадков. Метаболическая активность была высокой и сравнима с таковой в некоторых почвах.

Харрис и др. (2012), изучая различные режимы внесения удобрений, обнаружили, что, если выразить это как тепловыделение на единицу микробной биомассы почвы, микробные сообщества при режимах внесения органических удобрений производят меньше отработанного тепла, чем при неорганических режимах.

Наука о еде

Было показано, что IMC находит разнообразное применение в пищевой науке и технологиях. В обзоре (Wadsö and Galindo 2009) обсуждаются успешные применения при оценке дыхания на ранах от резки овощей, гибели клеток в результате бланширования, ферментации молока, предотвращения микробиологической порчи, термической обработки и срока годности. Другая публикация (Галиндо и др., 2005) рассматривает успешное использование IMC для мониторинга и прогнозирования изменений качества во время хранения минимально обработанных фруктов и овощей.

IMC также доказал свою эффективность при проведении ферментативных анализов на оротовую кислоту в молоке (Анастаси и др., 2000 г.) и яблочную кислоту во фруктах, винах и других напитках, а также в косметических продуктах (Антонелли и др., 2008 г.). IMC также использовался для оценки эффективности средств против потемнения свежесрезанного картофеля (Rocculi et al. 2007). IMC также доказал свою эффективность при оценке степени, в которой низкоэнергетические импульсные электрические поля (PEF) влияют на теплоту прорастания семян ячменя, что важно в связи с их использованием в производстве солодовых напитков (Dymek et al. 2012).

Some sources for IMC instruments, accessories, supplies, and software